劉冬冬，屈寶澤，李今朝

（1.錦州醫(yī)科大學，遼寧錦州 121000； 2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121000）

動脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS） 是一種由多因素引起的，以高度特異性的細胞分子反應為特征的慢性炎癥過程，主要累及大、中動脈。其病因尚不清楚，但動脈粥樣硬化的發(fā)病機制與炎癥中發(fā)生的幾種現(xiàn)象有關，包括巨噬細胞的激活、促炎細胞因子的釋放、生長因子的過度分泌和淋巴細胞的局部活化［1］。盡管動脈粥樣硬化的基礎和臨床研究取得了很大進展，但它仍然是目前最常見的心血管疾病之一，也是世界上導致死亡的主要原因之一［2-3］。炎癥在AS 的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用，在動脈粥樣硬化斑塊形成期間，循環(huán)的單核細胞進入血管壁的內皮下并轉化為巨噬細胞，隨后吞噬氧化的低密度脂蛋白 （OX-LDL） 后變成泡沫細胞［4］，泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變的標志［5］。因此，如何抑制泡沫細胞的形成及以炎癥為研究目標，或成為治療動脈粥樣硬化的關鍵。

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativusL.的干燥柱頭，是自然界存在的唯一水溶性類胡蘿卜素。近年來國內外大量研究表明，西紅花苷在抗心血管系統(tǒng)疾病、抗氧化［6］、抗高血壓、抗動脈粥樣硬化［7］、抗炎［8］、防治糖尿病并發(fā)癥等方面有很高的藥用價值。雖然西紅花苷的藥理作用十分廣泛，但是西紅花苷的藥理機制目前研究尚少。本實驗從炎癥的角度出發(fā)，探討西紅花苷通過抑制脂質代謝及相關炎癥因子，進而抑制泡沫細胞的形成，發(fā)揮抗AS的作用。

1 材料

1.1 細胞 小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 西紅花苷（批號42553-65-1，純度≥98%） 購自上海源葉生物科技有限公司；氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL，批號LW-6002，純度98%，2 mg）、油紅O 染色試劑盒、白介素1β （IL-1β） ELISA 檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α （TNF-α） ELISA 檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、MTT 均購自沈陽萬類生物科技有限公司；單核細胞趨化蛋白1 （MCP-1） 檢測試劑盒購自優(yōu)爾生商貿有限公司；總膽固醇（T-CHO） 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；p65、GAPDH 抗體均購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 超速冷凍離心機（H-2050R，湖南長沙湘儀檢測設備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（HF-90，上海力申科學儀器有限公司）；倒置相差顯微鏡（IX-53，日本Olympus 公司）；酶標儀（ELX-800，美國BioTek 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長至為90% 左右，加入胰酶消化細胞，按1∶2 進行傳代。

2.2 分組及給藥 分為正常組、模型組及西紅花苷低、中、高劑量組。將細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，正常組細胞正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組組加入50 μg／mL 氧化低密度脂蛋白，西紅花苷低、中、高劑量組加入50 μg／mL的氧化低密度脂蛋白和0.01、0.1、1 μmol／L 西紅花苷，細胞處理12、24、48 h。

2.3 油紅O 染色鑒定泡沫細胞模型 （1） 漂洗，棄上清，用37 ℃PBS 漂洗2 次；（2） 固定，加入4% 多聚甲醛室溫固定20 min；（3） 染色，吸棄多聚甲醛，加入1.5 mL油紅O 染色15 min；（4） 脫色，吸棄染色液，向培養(yǎng)板孔中加入1.5 mL 75% 乙醇，除去多余染色液，再用PBS 漂洗2 次，至沒有可見的紅色物質漂??；（5） 晾片，用干凈的鑷子取出蓋玻片，置于干凈的臺面上晾干；（6） 封片，用甘油明膠封片；（7） 顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 MTT 法篩選藥物最適時間及濃度梯度 將細胞接種于96 孔板中，5×103／孔，每組設置5 個復孔，待細胞貼壁后依次加入0.01、0.1、1、10、100 μmol／L西紅花苷，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中處理12、24、48 h。將達到特定時間的各組細胞棄去培養(yǎng)基，更換成0.5 mg／mLMTT 混合液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h 后小心吸去上清，加入150 μL DMSO 以溶解細胞形成的紫色結晶，避光靜置10 min 后在酶標儀上測定其在570 nm 處OD。

2.5 細胞上清液指標檢測 取各組細胞上清，COD-PAP單試劑比色法檢測總膽固醇水平、ELISA 檢測IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.6 Western blot 檢測NF-κB 蛋白表達 采用BCA 法檢測蛋白濃度，用SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜，用5% 脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 漂洗3 次，加入二抗（1∶5 000），室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST 漂洗3 次；免疫印跡顯色，Image-J 軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行分析，計量資料以（） 表示，符合正態(tài)分布采用F及q檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗，不同時間點采用重復測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞圖片及油紅O 染色鑒定 細胞圖片如圖1 所示，染色結果如圖2 所示，細胞內充滿橘紅色脂滴，細胞形態(tài)如同指環(huán)，說明泡沫細胞造模成功。

3.2 西紅花苷對細胞活性的影響 MTT 法檢測結果顯示，在0.01～100 μmol／L 范圍內，西紅花苷對RAW264.7 細胞的增殖作用逐漸減弱，同一組內隨培養(yǎng)時間的延長細胞活性逐漸增加（圖3）。選取0.01、0.1、1 μmol／L 西紅花苷進行后續(xù)實驗。

3.3 西紅花苷對泡沫細胞總膽固醇（T-CHO） 水平的影響 與正常組比較，模型組膽固醇水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，西紅花苷高劑量組膽固醇水平下降（P＜0.05）。見表1。

3.4 西紅花苷對泡沫細胞IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平的影響 與正常組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平上調（P＜0.01）；與模型組比較，西紅花苷中、高劑量組IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平下調（P＜0.05，P＜0.01）。給藥后時間對同一藥物組影響不大，不同時間點所測同一藥物組IL-1β 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2～4。

圖1 各組細胞形態(tài)

圖2 細胞油紅染色（×400）

圖3 0.01～100 μmol／L 西紅花苷對RAW264.7 細胞增殖的影響

表1 不同濃度西紅花苷對T-CHO 水平的影響（mmol／g prot，， n＝3）

表1 不同濃度西紅花苷對T-CHO 水平的影響（mmol／g prot，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05。

表2 不同濃度西紅花苷對IL-1β 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

表2 不同濃度西紅花苷對IL-1β 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表3 不同濃度西紅花苷對TNF-α 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

表3 不同濃度西紅花苷對TNF-α 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表4 不同濃度西紅花苷對MCP-1 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

表4 不同濃度西紅花苷對MCP-1 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 西紅花苷對泡沫細胞炎癥通路NF-κB 的影響 與正常組比較，模型組NF-κB 蛋白表達上調（P＜0.01）；與模型組比較，西紅花苷各藥物組NF-κB 蛋白表達降低（P＜0.01），且隨藥物濃度的增加，NF-κB 蛋白表達呈劑量依賴性下降；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組NF-κB 蛋白表達下調（P＜0.05）。見圖4。

4 討論

AS 的發(fā)病機制復雜，曾有多種學說從不同的角度闡述，包括脂質代謝紊亂學說、內皮損傷學說、炎癥反應學說、壁面切應力等。近年來“炎癥-反應-損傷”學說得到廣泛的支持，起源于單核細胞或巨噬細胞的多種細胞因子，如異常的炎癥趨化因子、細胞因子等參與動脈粥樣硬化進程［9-10］。NF-κB 是一種關鍵的核轉錄因子，與炎癥反應的調節(jié)密切相關［11］。NF-κB 信號通路在AS 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，此信號通路的激活是炎癥反應的核心，泡沫細胞的形成是AS 早期的炎癥細胞。NF-κB 在正常的血管中含有量很少，在AS 中的巨噬細胞和內皮細胞NF-κB 被大量的激活，說明NF-κB 參與了AS 的調控［12-13］。NF-κB信號通路相關信號有TNF-α、IL-1β、MCP-1，這些炎癥因子受NF-κB 的調控，可以影響NF-κB 的活化。

近幾年，中藥抗AS 日漸成為研究的熱點，越來越多的中藥復方和提取物已經(jīng)被成功運用到AS 和冠心病的治療中［14］，其作用溫和、毒副作用小、不易殘留、免疫藥理調節(jié)作用明顯，在預防和治療心血管疾病方面，具有明顯優(yōu)勢［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，西紅花苷在降脂、抗炎、抗AS、抗血小板聚集及心臟保護方面具有顯著的藥理作用。Zheng等［17］研究顯示，高脂飲食喂養(yǎng)的家兔在主動脈中出現(xiàn)嚴重的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化，同時VCAM-1 的蛋白和mRNA 表達均顯著上調，而給予西紅花苷的家兔可顯著改善動脈粥樣硬化，同時VCAM-1 表達顯著降低。表明西紅花苷具有抗AS 的作用，其機制可能是降低NF-κB 的活性，抑制血管細胞黏附分子-1 （VCAM-1） 表達，從而發(fā)揮抗AS 的作用。

圖4 西紅花苷對泡沫細胞炎癥通路NF-кB 的影響

在本研究中，用50 μg／mL 氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL）誘導建立泡沫細胞模型。各藥物組中膽固醇的水平均低于模型組，且隨給藥濃度增加膽固醇的水平逐漸降低，表明西紅花苷具有降脂作用。各藥物組中炎癥因子的水平均低于模型組，且隨給藥濃度的增加逐漸降低，表明西紅花苷對炎癥因子IL-1β、TNF-α、MCP-1 有抑制作用。各藥物組中NF-κB 表達均低于模型組，表明西紅花苷可以通過抑制NF-κB 通路活性來發(fā)揮抗AS 的作用。

綜上所述，西紅花苷可降低泡沫細胞中膽固醇及相關炎癥因子水平，并且可能通過抑制NF-κB 信號通路來實現(xiàn)的。