龍香麗 梁清延高 宏Anatoly Politov李彥生陳美玲

（1.大連交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116028； 2.廣西玉柴機(jī)器配件制造有限公司，廣西玉林 537000）

薯蕷科植物在全世界有9 個(gè)屬、650 多個(gè)品種，其中薯蕷屬就有600 種左右，主要分布在東南亞、南美等熱帶、亞熱帶地區(qū)［1-2］。我國(guó)薯蕷資源豐富，該屬植物約有50 種，主要分布于陜西、江西、湖北、湖南、四川、云南、貴州、廣州等地［3］，東北地區(qū)及內(nèi)蒙故也有分布，最早記載見(jiàn)于《山海經(jīng)》，宋代、明代、清代等均有使用記載［4］。其中，穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino 對(duì)氣候、土壤的要求低，種植廣泛。

穿龍薯蕷根莖中皂苷含有量較高，是生產(chǎn)薯蕷皂苷、皂苷元的主要原材料之一［5］，我國(guó)是提供薯蕷皂苷元的最大供應(yīng)商，每年產(chǎn)量約為5 000 噸［6］?，F(xiàn)階段薯蕷皂苷元生產(chǎn)工藝主要是傳統(tǒng)的先水解后提取的Rothrok 法，以及先提取后水解的Marker 法［7-8］，但前者對(duì)酸需求量大，污染嚴(yán)重，而后者對(duì)溶劑需求量大，回收成本高，均存在一定局限性，會(huì)破壞環(huán)境［9-10］。本實(shí)驗(yàn)采用薯蕷皂苷水分離法，先分離出纖維和淀粉作為附屬資源，并對(duì)皂苷漿料進(jìn)行富集濃縮（實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的工藝，富集率高達(dá)98%以上），再經(jīng)高溫高壓水解制備皂苷元，不僅在分離階段即實(shí)現(xiàn)無(wú)溶劑提取，附屬資源得以回收，且在水解階段減少酸用量，縮短酸解時(shí)間，從而降低制備成本。

1 材料

1.1 藥材 穿龍薯蕷根莖干片由廣東陽(yáng)江生物科技有限公司提供，經(jīng)廣東陽(yáng)江生物科技有限公司郭高工程師鑒定為正品，表皮呈褐色，根須較少。

1.2 試劑與藥物 薯蕷皂苷元對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111539-200001）。乙腈為色譜純（上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；石油醚（60～90 ℃）、濃硫酸、高氯酸、甲醇、香莢蘭醛等均為分析純；水為蒸餾水和超純水（自制）。

1.3 儀器 FA-JA 型電子天平（上海精科儀器有限公司）；DHG-9040 型真空干燥箱 （上海琦互儀器有限公司）；TGL-10B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DF-101S 型恒溫水浴鍋（鄭州生化儀器有限公司）；JYL-Y925 型破壁機(jī)（九陽(yáng)豆業(yè)有限公司）；ZNHW1 000 mL 型恒溫電熱套（上海羌強(qiáng)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；S212-2 L 型高壓反應(yīng)釜（上海森闖儀器有限公司）；UV-9600 型紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；索氏提取器。

2 方法

2.1 工藝流程 稱(chēng)取100 g 穿龍薯蕷根莖干片于燒杯中，加入適量蒸餾水使其在液面以下，浸泡4 h 后取出，置于破壁機(jī)中，加入400 mL 蒸餾水，10 000 r／min 打漿，篩網(wǎng)過(guò)濾漿液，殘?jiān)谜麴s水洗滌后再次倒入篩網(wǎng)中過(guò)濾，洗滌得到纖維，濾液靜置20 min 后倒出上層液，收集容器底部沉淀，洗滌后得到淀粉。合并洗滌液和倒出的上層液作為懸濁液，對(duì)其進(jìn)行處理，再次分離出部分淀粉，合并、富集懸濁液，得到薯蕷皂苷漿料，將其置于反應(yīng)釜中進(jìn)行高溫高壓水解，過(guò)濾并洗滌酸解物至中性，加入石油醚，索氏提取器（80 ℃） 提取6 h，結(jié)晶，即得薯蕷皂苷元。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 分光光度法 參考文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道測(cè)定纖維、淀粉中薯蕷皂苷元含有量。稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的薯蕷皂苷元對(duì)照品4.3 mg 于25 mL 量瓶中，甲醇定容，作為對(duì)照品溶液，精密吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL對(duì)照品溶液于10 mL 試管中，80 ℃水浴揮去溶劑，分別加入新配制的0.2 mL 5%香夾蘭醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，搖勻，置于70 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冰水冷卻后加冰醋酸定容至10 mL，加蓋放置30 min，在457 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝21.022X-0.007 8 （R2＝0.995 4），在1.72～18.92 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將石油醚提取液于70 ℃水浴中揮發(fā)至干，甲醇溶解后定容于200 mL 量瓶中，精密吸取0.2 mL 于10 mL 試管中，80 ℃水浴揮去溶劑。加入新配制的0.2 mL 5%香夾蘭醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，搖勻，置于70 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冰水冷卻后加冰醋酸定容至10 mL，加蓋放置30 min，在457 nm 處測(cè)定其吸光度，將其代入回歸方程中得到皂苷元質(zhì)量濃度，再換算成皂苷元含有量。

2.2.2 HPLC 法 參考文獻(xiàn)［13-14］報(bào)道測(cè)定皂苷元純度。

2.2.2.1 色譜條件 All-tima C18色譜柱 （150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水 （90∶10）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取薯蕷皂苷元對(duì)照品10 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解，即得（每1 mL 含0.4 mg 該成分）。

2.2.2.3 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取皂苷元5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，即得 （每1 mL 含0.2 mg 該成分）。

2.2.2.4 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液0.5、1.25、2.5、3.75、5、6.25 mL，置于10 mL 量瓶中，在“2.2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.136 6X＋44.658 （r＝0.999 3），在100～2 500 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3 結(jié)果

3.1 薯蕷皂苷分離

3.1.1 破壁時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元損失率的影響 圖1 顯示，當(dāng)破壁時(shí)間為20 s 時(shí)效果不佳，漿料中殘留有塊狀根莖，過(guò)篩時(shí)進(jìn)入纖維中，導(dǎo)致薯蕷皂苷嚴(yán)重?fù)p失；延長(zhǎng)至40 s時(shí)薯蕷根莖已基本破壁，薯蕷皂苷元損失率僅為0.08%；繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，該成分損失率降低程度不明顯，而且纖維分離量不斷減少。因此，確定破壁時(shí)間為40 s。

圖1 破壁時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元損失率的影響

3.1.2 篩網(wǎng)目數(shù)對(duì)薯蕷皂苷元損失率的影響 圖2 顯示，當(dāng)篩網(wǎng)目數(shù)≥300 目時(shí)薯蕷皂苷元損失率增加程度較緩慢；在400 目時(shí)該成分損失率迅速增加，達(dá)0.44%，其原因是篩網(wǎng)目數(shù)過(guò)小時(shí)部分被纖維包裹的薯蕷皂苷殘留在纖維中而造成損失?？紤]到纖維過(guò)濾難易程度、濾液中纖維含有量、后期水解時(shí)酸用量，確定篩網(wǎng)目數(shù)為200 目。

3.1.3 纖維洗滌次數(shù)對(duì)薯蕷皂苷元損失率的影響 表1 顯示，纖維洗滌6 次后分離得到的纖維量?jī)H有8%，再測(cè)定薯蕷皂苷元含有量，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，隨著纖維洗滌次數(shù)增加，纖維中薯蕷皂苷元含有量不斷減少，損失率不斷降低，洗滌3 次時(shí)損失率僅為0.06%，繼續(xù)洗滌時(shí)變化較小。綜合考慮用水量及后續(xù)處理量，確定纖維洗滌次數(shù)為3 次，纖維量為18%。

圖2 篩網(wǎng)目數(shù)對(duì)薯蕷皂苷元損失率的影響

表1 纖維洗滌次數(shù)對(duì)纖維量的影響

3.1.4 淀粉洗滌次數(shù)對(duì)薯蕷皂苷元損失率的影響 表2 顯示，淀粉洗滌3 次后淀粉量為24%，再測(cè)定薯蕷皂苷元含有量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，隨著淀粉洗滌次數(shù)增加，淀粉中薯蕷皂苷元含有量不斷減少。損失率不斷降低，洗滌3 次時(shí)幾乎檢測(cè)不到該成分。因此，確定淀粉洗滌次數(shù)為3 次，淀粉量為24%。

表2 淀粉洗滌次數(shù)對(duì)淀粉量的影響

3.2 薯蕷皂苷元制備 將調(diào)節(jié)好硫酸濃度的薯蕷皂苷漿料從高溫高壓反應(yīng)釜的進(jìn)料口傾入釜中，關(guān)閉進(jìn)料閥，并確定其他閥門(mén)處于關(guān)閉狀態(tài)，加壓至2 MPa （經(jīng)優(yōu)化得到），打開(kāi)攪拌開(kāi)關(guān)，設(shè)置好水解保溫時(shí)間和水解保溫溫度后進(jìn)行水解。反應(yīng)結(jié)束后，將料液從出料口放出，水解過(guò)程可使薯蕷皂苷糖基脫落生成而薯蕷皂苷元。

圖4 淀粉洗滌次數(shù)對(duì)薯蕷皂苷元含有量及損失率的影響

3.2.1 硫酸濃度對(duì)薯蕷皂苷元收率的影響 圖5 顯示，隨著硫酸濃度增加，薯蕷皂苷元收率呈先升后降的趨勢(shì)，在1 mol／L 時(shí)最高，達(dá) 3.04%。因此，確定硫酸濃度為1 mol／L。

圖5 硫酸濃度對(duì)薯蕷皂苷元收率的影響

3.2.2 保溫時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元收率的影響 圖6 顯示，隨著保溫時(shí)間延長(zhǎng)，薯蕷皂苷元收率呈先升后降的趨勢(shì)，在60 min 時(shí)水解較充分，但繼續(xù)延長(zhǎng)后該成分出現(xiàn)分解，導(dǎo)致收率反而下降。因此，確定保溫時(shí)間為60 min。

圖6 保溫時(shí)間對(duì)薯蕷皂苷元收率的影響

3.2.3 保溫溫度對(duì)薯蕷皂苷元收率的影響 圖7 顯示，隨著保溫溫度增加，薯蕷皂苷元收率呈先升后降的趨勢(shì)，在130 ℃時(shí)水解較充分，但繼續(xù)升高后該成分出現(xiàn)分解，導(dǎo)致收率反而下降。因此，確定保溫溫度為130 ℃。

圖7 保溫溫度對(duì)薯蕷皂苷元收率的影響

3.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇保溫時(shí)間（A）、硫酸濃度（B）、保溫溫度（C） 作為影響因素，薯蕷皂苷元收率（Y） 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化水解工藝，因素水平見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，各因素影響程度依次為保溫時(shí)間＞硫酸濃度＞保溫溫度，最優(yōu)工藝為A2B2C2，即保溫時(shí)間60 min，硫酸濃度1 mol／L，保溫溫度130 ℃。

表3 因素水平

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

取穿龍薯蕷根莖100 g，浸泡4 h 后取出，置于破壁機(jī)中，加入400 mL 水破壁40 s，200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，纖維、淀粉各洗滌3 次，合并洗滌液、濾液，富集濃縮后得到薯蕷皂苷漿料，用硫酸將其配制成1 mol／L 料液，置于高溫高壓反應(yīng)釜中，在特定壓力下不斷攪拌，130 ℃下保溫60 min，水解料液過(guò)濾、洗滌至中性，105 ℃下干燥后打包，80 ℃下石油醚索氏提取6 h，結(jié)晶得到薯蕷皂苷元，進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5，可知該成分純度符合行業(yè)要求（≥95%）。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（， n＝3）

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（， n＝3）

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)，得到穿龍薯蕷根莖中薯蕷皂苷元的最優(yōu)分離工藝為破壁時(shí)間40 s，篩網(wǎng)目數(shù)200 目，纖維洗滌次數(shù)3 次，淀粉洗滌次數(shù)3 次；最優(yōu)水解工藝為保溫時(shí)間60 min，硫酸濃度1 mol／L，保溫溫度130 ℃，該成分收率為3.07%，純度為96.25%，符合行業(yè)相關(guān)要求。

由于國(guó)家對(duì)環(huán)境保護(hù)的要求日益嚴(yán)格，薯蕷皂苷元產(chǎn)業(yè)正面臨著轉(zhuǎn)型升級(jí)，開(kāi)發(fā)綠色節(jié)能的制備工藝迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水分離出薯蕷皂苷漿料后再進(jìn)行高溫高壓水解，不僅可無(wú)溶劑提取，附屬資源得以回收，而且能降低后續(xù)水解酸用量，縮短保溫時(shí)間，節(jié)約制備成本。今后，將致力于開(kāi)發(fā)不使用有機(jī)溶劑的薯蕷皂苷元綠色分離工藝。