張 剛李 偉趙生俊李 茜
(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院,新疆烏魯木齊 830000; 2.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所,新疆烏魯木齊 830011; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)
中藥炮制輔料羊脂油系??苿?dòng)物綿羊Ovis aries linnaeus或山羊Capra hircuslinnaeus的脂肪油經(jīng)過(guò)煉制而得,具有溫散寒邪、補(bǔ)腎助陽(yáng)、補(bǔ)虛潤(rùn)燥之功效,但其藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在各類炮制規(guī)范中均未作出明確規(guī)定,導(dǎo)致質(zhì)量得不到控制[1-3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),羊脂油含有大量脂肪酸類成分,如油酸、硬脂酸、棕櫚酸、甘油酯等,均具有脂肪長(zhǎng)鏈及表面活性,可促進(jìn)形成膠束、囊泡等多種藥物載體的超分子自組裝體結(jié)構(gòu),促進(jìn)藥物吸收,同時(shí)具有降血脂等作用的油酸、棕櫚酸總含有量超過(guò)總脂肪酸量的50%,故選擇兩者作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
課題組前期對(duì)新疆地區(qū)不同來(lái)源和部位的羊脂油進(jìn)行比較,通過(guò)商家調(diào)研、性狀鑒別、GC-MS 測(cè)定脂肪酸含有量來(lái)篩選脂肪來(lái)源部位,最終確定阿勒泰羊(肥臀羊) 的羊尾油作為新疆地區(qū)炮制輔料,其脂肪油得率和有效成分(油酸、棕櫚酸) 含有量高,性狀符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)在比較羊脂油煉制前后物理參數(shù)及有效成分的基礎(chǔ)上篩選煉制時(shí)間、煉制溫度、加水量,規(guī)范該輔料煉制工藝,并為進(jìn)一步制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。
Agilent 7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技公司);C21-RT2120 電磁爐 (美的集團(tuán)股份有限公司);VC200152 數(shù)顯溫度(秦皇島維克托國(guó)際貿(mào)易有限公司);AG-135 電子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司);SK-3300LH 超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);電熱恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠);DZKW 電子恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。羊脂油源自新疆阿勒泰羊 (肥臀羊) 的羊尾油。所有試劑均為色譜純。
2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道。HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);體積流量0.9 mL/min;不分流;程序升溫(起始溫度100 ℃,以10 ℃/min 速率升至150 ℃,5 ℃/min 速率升至250 ℃,保持5 min);載氣氦氣;檢測(cè)器溫度300 ℃;運(yùn)行時(shí)間30 min;進(jìn)樣量0.5 μL。
2.2 質(zhì)譜條件 電離方式EI;電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度280 ℃;質(zhì)量掃描范圍m/z50~600;溶劑延遲3 min。
2.3 供試品溶液制備 采用三氟化硼-甲醇法。精密稱取羊脂油0.1 g,置于50 mL 圓底燒瓶中,加入5 mL NaOH-甲醇溶液(0.5 mol/mL),60 ℃水浴回流30 min,待油滴全部消失后再加入5 mL 三氟化硼-甲醇溶液回流提取5 min,冷卻至室溫,精密加入5.0 mL 正己烷振搖5 min,15 mL 飽和氯化鈉溶液洗滌2 次,靜置分層,上清液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥,即得。
2.4 定量分析 對(duì)羊脂油總離子流色譜圖通過(guò)NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索,并結(jié)合相關(guān)資料進(jìn)行人工解析以確認(rèn)成分,歸一化法計(jì)算各峰面積相對(duì)含有量。
2.5 羊脂油制備 將新鮮羊尾油剁成1 寸左右的小塊后清洗干凈、控干水分,并事先加入清水以防止粘連,同時(shí)應(yīng)注意火候掌控。將煉制好的羊脂油盛放在潔凈干燥的容器中備用。
2.6 煉制工藝優(yōu)化
2.6.1 單因素試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道。
2.6.1.1 煉制溫度 2008 年版《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》 規(guī)定,文火溫度為80~120 ℃,中火溫度為120~150 ℃,武火溫度為150~220、220~280 ℃。本實(shí)驗(yàn)固定1.0 kg 羊脂油的加水量為10%,煉制時(shí)間為7 min,發(fā)現(xiàn)隨著煉制溫度升高,油脂色澤由橙黃色逐漸加深至棕黃色,透明度不斷降低,最后變至渾濁;氣味逐漸異常,發(fā)煙情況逐漸嚴(yán)重,可能是由于油脂中混入殘?jiān)坝坞x脂肪酸含有量升高所致[8];酸值、過(guò)氧化值逐漸增加,皂化值、羥值、碘值略有下降,可能是因?yàn)闇囟壬邥r(shí)被氧化程度增加,從而影響其質(zhì)量[9];水分、灰分、熔點(diǎn)、比重與溫度均無(wú)明顯相關(guān)性。最終,選擇80~120、120~150、150~220 ℃作進(jìn)一步研究。
2.6.1.2 加水量 在炒制過(guò)程中加少量水是為了盡快融化羊脂油且不粘鍋,但加水量無(wú)統(tǒng)一規(guī)定,過(guò)少容易粘到炮制器皿,過(guò)多則會(huì)影響煉制時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)固定1.0 kg 羊脂油的煉制溫度為150~220 ℃,煉制時(shí)間為7 min,發(fā)現(xiàn)隨著加水量增加,羊脂油色澤、透明度、氣味、酸值、過(guò)氧化值無(wú)明顯變化,而皂化值、羥值、碘值略有上升,可能是由于其被氧化程度減緩所致。最終,選擇5%、10%、15%作進(jìn)一步研究。
2.6.1.3 煉制時(shí)間 炒制程度是衡量中藥飲片炮制質(zhì)量的重要指標(biāo),多數(shù)僅靠人為經(jīng)驗(yàn)判斷待油出盡、油渣呈現(xiàn)老黃色作為標(biāo)準(zhǔn),但羊脂油容易炒焦,僅根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。本實(shí)驗(yàn)固定1.0 kg 羊脂油的煉制溫度為150~220 ℃,加水量為10%,發(fā)現(xiàn)隨著煉制時(shí)間延長(zhǎng),羊脂油色澤由橙黃色逐漸加深至黃黑色,透明度不斷降低,最后變至渾濁,氣味逐漸異常,發(fā)煙情況逐漸嚴(yán)重,可能是由于油脂中混入殘?jiān)坝坞x脂肪酸含有量升高所致[10];酸值、過(guò)氧化值逐漸增加,而皂化值、羥值、碘值略有下降,可能是因?yàn)闀r(shí)間延長(zhǎng)時(shí)被氧化程度增加,從而影響其質(zhì)量[11];水分、灰分、熔點(diǎn)、比重與時(shí)間均無(wú)明顯相關(guān)性。最終,選擇7、9、12 min 作進(jìn)一步研究。
2.6.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇煉制溫度(A)、加水量(B)、煉制時(shí)間(C) 作為影響因素;油酸、棕櫚酸總含有量及出油率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),計(jì)算綜合評(píng)分(Y)[7-8,12],公式為Y= (60% /油酸、棕櫚酸總含有量最大值) ×油酸、棕櫚酸總含有量+(40% /出油率最大值) ×出油率,正交試驗(yàn)優(yōu)化煉制工藝。因素水平見(jiàn)表1,結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。
表1 因素水平
由此可知,各因素影響程度依次為A(煉制溫度) >C(煉制時(shí)間) >B(加水量),其中A、C有顯著影響(P<0.05);最優(yōu)工藝為A2B1C2,即將羊尾油切制成1 寸左右的小塊,加入5%水加熱150~220 ℃后煉制9 min。
2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.7”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4,可知該工藝穩(wěn)定可行。
表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表3 方差分析
表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)
本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化羊脂油煉制工藝過(guò)程中,將原料切制成立方塊以便于炮制,但體積過(guò)小會(huì)增加工作量,體積過(guò)大會(huì)炮制不均勻而存在外焦里生的現(xiàn)象。最終確定,將羊脂油剁成1 寸左右的小塊,清洗干凈、控干水分后備用。
以前煉制羊脂油時(shí),僅憑經(jīng)驗(yàn)判斷待油出盡、油渣呈老黃色作為終點(diǎn),但其容易炒焦,故僅通過(guò)外觀性狀觀察并不能很好地反應(yīng)煉制程度,還應(yīng)對(duì)其主要理化指標(biāo)及油酸、棕櫚酸總含有量進(jìn)行詳細(xì)描述。溫度是煉制的重要參數(shù),但各版相關(guān)規(guī)范較混亂;在炒制過(guò)程中加少量水可盡快融化羊脂油且不粘鍋,但水量少容易粘到炮制器皿,而水量多會(huì)延長(zhǎng)煉制時(shí)間;煉制時(shí)間可影響羊脂油質(zhì)量,時(shí)間短則可能未到位,而時(shí)間長(zhǎng)氧化程度會(huì)變大,故本實(shí)驗(yàn)選擇煉制溫度、加水量、煉制時(shí)間作為影響因素。
將羊脂油進(jìn)行甲酯化后,通過(guò)GC-MS 法分析其脂肪酸類成分,面積歸一化法測(cè)定相對(duì)含有量。結(jié)果,羊脂油中含有16 種脂肪酸,其中不飽和脂肪酸有9 種,占54.48%,主要為油酸、反式9-十八碳烯酸,還有少量亞油酸;飽和脂肪酸有7 種,占40.13%,主要為棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻酸;具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化[8-12]的油酸、棕櫚酸總含有量站總脂肪酸量的50%,故以兩者為評(píng)價(jià)指標(biāo),以期在優(yōu)化煉制工藝下既可保證出油量,又能得到高質(zhì)量原料。