田孟華袁天軍周 瑞楊新周

（1.昭通市天麻研究院，云南昭通 657000； 2.德宏師范高等?？茖W(xué)校民族醫(yī)藥研究所，云南德宏 678400； 3.德宏師范高等?？茖W(xué)校理工學(xué)院，云南德宏 678400； 4.云南華衡檢測技術(shù)有限公司，云南昆明 650106）

天麻為蘭科真菌營養(yǎng)型多年生草本植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列上品［1］，在中國等東亞國家已有上千年的應(yīng)用歷史［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻對預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、免疫系統(tǒng)疾病具有一定功效［3-5］，臨床常用于治療頭暈?zāi)垦！⒅w麻木、癲癇抽搐、小兒驚風(fēng)、風(fēng)濕痹痛等癥［6-8］富含多種營養(yǎng)成分和礦質(zhì)元素［9］，已廣泛用于食品輔料，如“天麻蒸蛋”“天麻烏骨雞”“天麻粥”等［10］。它作為藥食同源滋補(bǔ)保健類藥材，含酚酸、甾醇、有機(jī)酸、脂類、多糖等多種成分，其中酚酸中的天麻素（Gas）、天麻腺苷、對羥基苯甲醇（HA）、對羥基苯甲醛（HBA）、巴利森A （PA）、巴利森苷B （PB）、巴利森苷C （PC）、巴利森苷E （PE） 是主要活性物質(zhì)［11-13］，具有鎮(zhèn)痛、降壓、抗驚厥、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用［14-15］，也是目前該藥材及其中成藥質(zhì)量評價的重要指標(biāo)成分［16］，但2015 年版《中國藥典》 僅規(guī)定天麻素、對羥基苯甲醇總量不得低于0.25%［2］。中藥材成分復(fù)雜，其多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用于機(jī)體，符合中醫(yī)整體論和系統(tǒng)論［17］，僅檢測單一或少數(shù)成分難以有效評價藥材質(zhì)量。不同產(chǎn)地種植的天麻隨栽培土壤、氣候環(huán)境變化，其功效和有效成分含有量均有較大差異，王信等［18］建立了6 種天麻素類成分的一測多評法用于質(zhì)量控制；王慶等［19-20］研究了西南地區(qū) （云南、貴州、四川） 3 種變型天麻（紅天麻、烏天麻、綠天麻）中多酚、多糖、氨基酸、天麻素、巴利森苷成分的含有量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、變種所含成分存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)廣泛采集全國主產(chǎn)地天麻，對其中8 種有效成分及總天麻素含有量進(jìn)行分析，利用差異性、相關(guān)性、主成分、因子載荷分析對不同產(chǎn)地及變型品種有效成分的差異特征及影響因素進(jìn)行探析，篩選相關(guān)標(biāo)志物，以期為藥材質(zhì)量評價及其產(chǎn)地、變型鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

LC-20A 型RP-HPLC 色譜儀 （配置LC-20AT高壓雙泵、SPD-20A 檢測器、SIL-20A 自動進(jìn)樣器，島津企業(yè)管理有限公司）；CP124C 電子分析天平 （萬分之一，奧豪斯儀器有限公司）；CP1502C 電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；RE-3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；乙醇、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純；水為超純水。腺苷對照品購于中國食品藥品檢定研究院；天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷對照品C 均購于上海源葉生物科技有限公司。

天麻采自云南、四川、湖北、貴州、陜西、安徽、甘肅、吉林等省，其中省外13 個、省內(nèi)8 個，經(jīng)昭通市天麻研究院田孟華工程師鑒定為正品，具體見表1。樣品切片自然晾干后粉碎，過0.3 mm篩，裝入自封袋中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 色譜條件 Inert Sustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫 （0～8 min，1%～2% B；8～15 min，2%～8% B；15～25 min，8% B；25～35 min，8%～15% B；35～45 min，15% B；45～50 min，15%～20%B；50～60 min，20%B）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長270 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備及線性關(guān)系考察 乙腈-水（10∶ 90） 混合溶液將各對照品制成含腺苷0.020 4 mg／mL、天麻素0.100 8 mg／mL、對羥基苯甲醇0.062 8 mg／mL、對羥基苯甲醛0.010 0 mg／mL、巴利森苷A 0.200 4 mg／mL、巴利森苷B 0.201 6 mg／mL、巴利森苷C 0.200 8 mg／mL、巴利森苷E 0.202 4 mg／mL的溶液，即得。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。色譜圖見圖1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品2 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70% 乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，90 ℃水浴回流3 h，冷卻至室溫，70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，吸取10 mL 濾液2 份，蒸干。其中，1 份用10%乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，10%乙腈定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

另1 份用2%氫氧化鈉-10%乙腈混合溶液5 mL溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，搖勻，室溫放置2 h充分水解，5% 鹽酸調(diào)pH 至4～5，10% 乙腈稀釋5～10倍，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，作為總天麻素待測液。

3 結(jié)果

3.1 成分分析 表3 顯示，HBA、腺苷含有量以云南普洱21＃樣品最高，變異最小；Gas、PB 含有量以云南麗江19＃樣品最高，差異較大；云南昭通14＃、四川樂山1＃樣品、安徽安慶8＃、貴州同仁4＃樣品分別以PB、HA、PC、PA 含有量最高。由此可知，不同產(chǎn)地間有效成分含有量存在一定差異。

3.2 相關(guān)性分析 表4 顯示，天麻中不同有效成分含有量之間存在一定的相關(guān)性，其中腺苷與HA呈負(fù)顯著相關(guān)，與PE 呈顯著相關(guān)；PB、PC、PA、總天麻素與Gas 之間呈顯著或極顯著相關(guān)，HBA與P 呈顯著負(fù)相關(guān)。由此推測，可能存在相互轉(zhuǎn)化或累積代謝途徑的相互影響。

表3 不同產(chǎn)地樣品成分分析（mg／g）Tab.3 Composition analysis of samples from different growing areas （mg／g）

表4 天麻素及其他有效成分之間的相關(guān)性Tab.4 Correlations between gastrodin and the other effective components

3.3 天麻有效成分對不同產(chǎn)地的影響 采用SPSS 19.0 軟件結(jié)合SIMCA P ＋10.5 軟件對不同產(chǎn)地天麻有效成分含有量進(jìn)行主成分分析，提取主成分?jǐn)?shù)，并探析它對產(chǎn)地分類的影響。結(jié)果見表5、圖2～3。

表5 中，對不同產(chǎn)地21 批樣品中8 種有效成分及總天麻素采用最大方差化旋轉(zhuǎn)后降維分析，根據(jù)初始特征值≥1 的原則，發(fā)現(xiàn)不同成分對產(chǎn)地均具有一定影響，所提取的4 種主成分累積影響因子達(dá)85.161%，Gas、PB、PC、PA、總天麻素對第1主成分具有較大貢獻(xiàn)，腺苷、HBA 對第2 主成分具有較大貢獻(xiàn)，HA 對第3 成分具有較大貢獻(xiàn)，PE對第4 主成分具有較大影響。其中，第1、2 主成分總累積貢獻(xiàn)率為53.911%，接近60%，表明兩者所提取的因子貢獻(xiàn)率對產(chǎn)地分析具有較大影響。

表5 旋轉(zhuǎn)后不同產(chǎn)地樣品有效成分提取結(jié)果Tab.5 Extraction results of effective components in samples from different growing areas after rotation

圖2 21 批樣品主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis plot for twenty-one batches of samples

由圖2 可知，8 種有效成分及總天麻素含有量可將不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行有效分類。其中，在主成分1、2 空間中云南、吉林產(chǎn)地樣品能有效分類，而四川、貴州、湖北產(chǎn)地樣品與云南產(chǎn)地較為接近，這可能與產(chǎn)地間的生態(tài)環(huán)境相近有關(guān)。圖3 表明，第1 主成分提取的HA、HBA、PE 對四川、云南產(chǎn)地樣品分類的影響較大，而PB、總天麻素、Gas、PA、PC 腺苷對湖北、陜西、貴州等產(chǎn)地樣品的分類具有較大影響，尤其是對湖北、陜西；第2 主成分提取的HA、HBA、PE、PB、Gas 對四川、云南、湖北產(chǎn)地樣品的分類具有正貢獻(xiàn)，而腺苷、PA、PC 對陜西、貴州、甘肅、安徽產(chǎn)地樣品的分類具有較大影響。由此顯示，不同產(chǎn)地天麻有效成分對其分類具有不同程度的影響。

圖3 各成分載荷圖Fig.3 Loading diagram of various constituents

3.4 天麻有效成分對不同變型天麻的影響 進(jìn)一步分析天麻內(nèi)在有效成分含有量對不同變型天麻的影響，結(jié)果見表6、圖4～5。

由表6 可知，提取的3 個主成分因子對變型分類的貢獻(xiàn)率達(dá)81.9%，表明三者能有效識別不同變型的樣品。

表6 不同變型主要有效成分提取結(jié)果（%）Tab.6 Extraction results of main active ingredients in different varieties （%）

圖4 不同變型主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot of different variations

由圖4 可知，8 種有效成分和總天麻素含有量可將不同變型天麻樣品進(jìn)行有效分類。其中，在主成分1、2 空間中烏綠天麻、烏天麻、綠天麻間存在較大差異，而黃天麻、紅天麻、烏紅天麻之間差異不明顯。對不同變型樣品進(jìn)行載荷分析時發(fā)現(xiàn)，Gas、HA、PE、PB、總天麻素對烏天麻分類具有較大的正貢獻(xiàn)，而PA 具有較大的負(fù)貢獻(xiàn)，其中PE、PA 可作為它與其他天麻變型之間差異性分析的標(biāo)志性物質(zhì)；腺苷、HA 對綠天麻分類分別具有較大負(fù)、正貢獻(xiàn)，可作為其分類的模式物質(zhì)；烏紅天麻、黃天麻、紅天麻之間相似度較高，主要區(qū)別在于HA、PE、PC、總天麻素、PA；烏綠天麻與其他天麻均具有較大差異，主要表現(xiàn)為除了HBA對其分類有正貢獻(xiàn)外，其余指標(biāo)均呈負(fù)貢獻(xiàn)。

圖5 有效成分對變型分類貢獻(xiàn)的影響Fig.5 Effects of active ingredients on classification contribution of varieties

4 討論與結(jié)論

不同產(chǎn)地種植的天麻隨栽培土壤、氣候環(huán)境變化，其有效成分含有量均具有較大差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地樣品8 種有效成分及總天麻素含有量具有一定差異，提取的特征成分可在主成分空間內(nèi)有效識別產(chǎn)地差異，也可用于不同變型的差異性識別，尤其是PE、PA，可作為烏天麻與其他天麻變型之間差異性分析的標(biāo)志物；腺苷、HA 對綠天麻分類分別具有較大負(fù)、正貢獻(xiàn)，可作為其分類的模式物質(zhì)。綜上所述，該方法可為后續(xù)天麻及其不同變型品質(zhì)的評價及鑒定提供新思路。