馮 芮 郭 力 蒲忠慧劉 娟彭 成*熊 亮*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都 611137； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川成都 611137； 3.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川成都 610500）

川芎Ligusticum striatumDC.為傘形科藁本屬多年生草本植物，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性辛、溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有祛風(fēng)止痛、活血行氣之功效，臨床可用治頭痛、月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)等癥［1］，至今已從中分離鑒定出170 余種成分，主要包括苯酞、萜烯及其烯醇、生物堿、甾醇、有機(jī)酸及其酯類(lèi)［2］、人參皂苷［3］等。然而，關(guān)于川芎化學(xué)成分的報(bào)道主要集中于極性較小的苯酞類(lèi)，對(duì)于大極性的酚酸類(lèi)、生物堿類(lèi)研究較少，課題組前期對(duì)川芎總生物堿的提取和純化工藝進(jìn)行了研究［4-5］，首次發(fā)現(xiàn)它對(duì)子宮平滑肌收縮具有顯著抑制作用［6］。目前，關(guān)于川芎生物堿抑制子宮平滑肌收縮的藥效物質(zhì)研究較少，僅發(fā)現(xiàn)川芎嗪［7］對(duì)縮宮素所致正常雌性小鼠子宮平滑肌劇烈收縮具有明顯的拮抗作用，故本研究利用現(xiàn)代提取分離手段，從川芎中獲得8 種生物堿，并采用縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮模型考察它們對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)化合物1～3 在50 μmol／L濃度下有顯著抑制作用。

1 材料

1.1 儀器 Rotavapor R-205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；Agilent 1220 半制備型HPLC 色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）。D101 大孔吸附樹(shù)脂（成都科龍化工試劑廠(chǎng)）；732 型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（河北華偉樹(shù)脂廠(chǎng)）；柱層析硅膠（200～300 目）、薄層層析硅膠GF254（青島海洋硅膠干燥劑廠(chǎng)）；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 （40～70 μm，美國(guó)Amersham Pharmacia 公司）；高效薄層GF254、硅膠制備薄層（煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司）；Powerlab 多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽和Labchart Pro 專(zhuān)業(yè)版軟件［澳大利亞埃德儀器國(guó)際貿(mào)易（上海） 有限公司］；FA2004B 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試劑 正丁醇、95%乙醇、二氯甲烷、甲醇、氨水等分析純?cè)噭ǔ啥伎坡』ぴ噭S(chǎng)）；色譜純甲醇（4 L／瓶，美國(guó)Sigma 公司）；顯色劑碘蒸氣、10%硫酸乙醇、改良碘化鉍鉀試劑。

1.3 藥材 川芎飲片由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中藥種質(zhì)資源庫(kù)高繼海副教授鑒定為傘形科多年生草本植物川芎Ligusticum striatumDC.的根莖，標(biāo)本現(xiàn)存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 （標(biāo)本號(hào)LC-20161030）。

2 提取與分離

取干燥川芎100 kg，加入8 倍量純水煎煮3次，每次2.5 h，藥液合并濃縮，得到水提物（28.8 kg），加熱水分散后用正丁醇萃取，減壓濃縮，得到正丁醇提取物9.3 kg，經(jīng)D101 大孔吸附樹(shù)脂富集，分別用純水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脫，回收溶劑得到6 個(gè)洗脫部分。50%乙醇洗脫部分（671 g） 經(jīng)離子交換樹(shù)脂富集生物堿，分別用純水、80%乙醇、80%氨水乙醇梯度洗脫，回收溶劑，得到3 個(gè)洗脫部分。80%氨水乙醇部分（176 g） 經(jīng)硅膠色譜柱，用氨水飽和的二氯甲烷-甲醇（100∶1～0∶1）洗脫，獲得12 個(gè)餾分（F1～F12）。

F1經(jīng)反相Sephadex LH-20 柱色譜 （80% 甲醇）、制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇＝20∶1）、半制備HPLC （48% 甲醇），分離得到化合物1（3.5 mg）、2 （8.4 mg）、3 （3.2 mg）。

F4經(jīng)ODS 反相中壓液相色譜，10%～100%甲醇梯度洗脫，得到12 個(gè)洗脫部分（F4-a～F4-l）。F4-f經(jīng)正相Sephadex LH-20 柱色譜（二氯甲烷-甲醇＝1∶1） 得到5 個(gè)部分（F4-f-1～F4-f-5），F(xiàn)4-f-2經(jīng)反相Sephadex LH-20 柱色譜（30%甲醇），得到7 個(gè)部分（F4-f-2a～F4-f-2g），F(xiàn)4-f-2b經(jīng)制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇-水＝3∶1∶0.1）、半制備HPLC （19% 甲醇），得到化合物4 （1.3 mg）；F4-f-3經(jīng)反相Sephadex LH-20 柱色譜（30%甲醇）、制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇-水＝2.5∶1∶0.1）、半制備HPLC （10%甲醇），得到化合物5 （1.3 mg）、6（1.2 mg）；F4-f-4經(jīng)反相Sephadex LH-20 柱色譜（30%甲醇）、制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇-水＝2.5∶1∶0.1）、半制備HPLC （20% 甲醇），得到化合物7 （0.8 mg）、8 （1.1 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm／z：261.2 ［M ＋H］＋。1HNMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.22～7.29 （5H，m，Ar-H），4.25～4.27 （1H，m，H-2′），3.25（1H，dd，J＝4.0，14.0 Hz，H-3a），3.01 （1H，dd，J＝4.0，14.0 Hz，H-3b），2.77～2.80 （1H，m，H-2），1.42～1.72 （3H，m，H-3′，4′），0.83（3H，d，J＝6.5 Hz，H-6′），0.78 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-5′）；13C-NMR （125 MHz，CD3OD）δ：167.5 （C-1′），166.1 （C-1），131.1 （C-4），130.4 （C-6，8），128.1 （C-5，9），126.7 （C-7），55.4 （C-2），52.2 （C-2′），43.6 （C-3），38.4 （C-3′），22.9 （C-4′），22.8 （C-6′），21.4（C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)（L-苯丙氨酸-L-亮氨酸）。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm／z：247.1 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz，DMSO-d6）δ：8.11 （1H，s，HPhe），7.91 （1H，s，H-Val），7.14～7.25 （5H，m，H-5～ H-9），4.21 （1H，m，H-2），3.52（1H，m，H-2′），3.14 （1H，dd，J＝4.2，13.2 Hz，H-3a），2.86 （1H，dd，J＝4.8，13.2 Hz，H-3b），1.69 （1H，m，H-3′），0.64 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-4′或H-5′），0.25 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-4′或H-5′）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ：167.1 （C-1′），166.9 （C-1），136.9 （C-4），130.8 （C-6，8），128.5 （C-5，9），127.0 （C-7），59.7 （C-2），55.6 （C-2′），38.3 （C-3），31.5 （C-3′），18.8 （C-4′），16.7 （C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)（L-苯丙氨酸-L-纈氨酸）。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；改良碘化鉍鉀顯藍(lán)色。ESI-MSm／z：261.2 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz，DMSO-d6）δ：8.12 （1H，s，HPhe），7.89 （1H，s，H-Ile），7.17～7.26 （5H，m，H-5～ H-9），4.21 （1H，m，H-2），3.58（1H，m，H-2′），3.16 （1H，dd，J＝4.2，13.2 Hz，H-3a），2.85 （1H，dd，J＝4.8，13.2 Hz，H-3b），1.39 （1H，m，H-3′），0.64 （2H，m，H-4′），0.56 （3H，m，H-5′或H-6′），0.54 （3H，m，H-5′或H-6′）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）

δ：166.4 （C-1′），166.3 （C-1），136.3 （C-4），130.4 （C-6，8），127.9 （C-5，9），127.0 （C-7），58.7 （C-2），55.0 （C-2′），37.8 （C-3），37.6 （C-3′），23.1 （C-4′），14.4 （C-5′），11.8（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道基本一致，故鑒定為環(huán)（L-苯丙氨酸-L-異亮氨酸）。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液不顯色，改良碘化鉍鉀不顯色。ESI-MSm／z：135.0 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.40 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-6），5.62 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-5）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：167.3 （C-4），153.5 （C-2），143.5 （C-6），101.7 （C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，故鑒定為尿嘧啶。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm／z：149.0 ［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：7.24 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），1.87 （3H，d，J＝1.2 Hz，H-7）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：167.5 （C-4），153.8 （C-2），139.2 （C-6），110.4 （C-5），12.1 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，故鑒定為胸腺嘧啶。

化合物6：淡黃色無(wú)定型粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液不顯色，改良碘化鉍鉀不顯色。ESI-MSm／z：148.0 ［M＋Na］＋。1HNMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.02 （1H，d，J＝2.4 Hz，H-2），7.37 （1H，d，J＝9.0 Hz，H-5），7.25 （1H，dd，J＝9.0，3.0 Hz，H-4），4.60（2H，s，H-7）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：155.1 （C-3），152.0 （C-6），137.4 （C-2），125.1 （C-5），123.3 （C-4），65.3 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道基本一致，故鑒定為6-羥甲基-3-羥基吡啶。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm／z：146.0 ［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：9.10 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-2），8.62 （1H，dd，J＝4.8，1.8 Hz，H-4），8.37（1H，dt，J＝7.8，2.4 Hz，H-5），7.49 （1H，dd，J＝7.8，4.8 Hz，H-6）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：170.86 （C-7），152.02 （C-6 ），151.21 （C-2），138.94 （C-4），132.59 （C-3），124.84 （C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道基本一致，故鑒定為煙酸。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm／z：136.1 ［M ＋ H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.20 （1H，s，H-2），8.13 （1H，s，H-8）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：156.8（C-6），153.2 （C-2），151.9 （C-4），141.2 （C-8），118.8 （C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，故鑒定為腺嘌呤。

4 對(duì)大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響

采用課題組前期建立的方法［6］，連續(xù)2 d 給大鼠灌胃戊酸雌二醇溶液（8 mg／kg／d） 復(fù)制動(dòng)情期大鼠模型。于第3 天頸椎脫臼處死大鼠并迅速剖取子宮，在盛有洛氏液的玻璃皿中取中間段子宮平滑肌2～3 cm，將肌條一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽中，另一端連接張力換能器，負(fù)重為1 g，用十六通道生理記錄系統(tǒng)記錄子宮收縮曲線(xiàn)。以160 μL 縮宮素復(fù)制子宮平滑肌收縮模型，DMSO 為空白對(duì)照，5×10-7mol／L 鹽酸維拉帕米為陽(yáng)性對(duì)照，給藥組3 個(gè)化合物濃度分別為1、10、50 μmol／L，均按照等體積給藥。給藥后，觀(guān)察離體子宮平滑肌的收縮張力及收縮活動(dòng)力（收縮張力平均值×收縮頻率，其中收縮頻率為10 min 內(nèi)子宮平滑肌的收縮次數(shù)），記錄10 min內(nèi)收縮曲線(xiàn)，計(jì)算給藥后收縮活力抑制率和收縮張力抑制率｛ ［（給藥前參數(shù)-給藥后參數(shù)） ／給藥前參數(shù)］×100%｝，重復(fù)6 次。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以 （x±s） 表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，多組間均數(shù)比較時(shí)采用單因素方差分析；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差齊性時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果，鹽酸維拉帕米和3 種生物堿均能不同程度抑制子宮平滑肌收縮。與空白組比較，加入鹽酸維拉帕米后收縮活力抑制率和收縮張力抑制率升高（P＜0.01），化合物1～3 均對(duì)子宮收縮活動(dòng)影響較小，僅高劑量組相對(duì)較明顯（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 化合物對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響（，n＝6，%）Tab.1 Effects of compounds on contractile activity of uterine smooth muscle （， n＝6，%）

表1 化合物對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響（，n＝6，%）Tab.1 Effects of compounds on contractile activity of uterine smooth muscle （， n＝6，%）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

5 討論

生物堿作為川芎主要活性物質(zhì)之一，目前發(fā)現(xiàn)的有川芎嗪、川芎哚、鹽酸三甲胺、鹽酸膽堿、尿嘧啶、腺苷等［13］，類(lèi)型涵蓋吡嗪類(lèi)、咔啉類(lèi)、季胺鹽類(lèi)、核苷類(lèi)，其藥理作用主要包括保護(hù)缺血性心肌細(xì)胞、保護(hù)缺血性-再灌注性損傷細(xì)胞、抑制子宮平滑肌收縮活動(dòng)等［1，6，14-19］。本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段從川芎中分離得到8 個(gè)生物堿，其中1～3 為二酮哌嗪類(lèi)，在藁本屬中鮮有報(bào)道?，F(xiàn)代藥理研究表明，二酮哌嗪類(lèi)生物堿具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、神經(jīng)保護(hù)、抗瘧疾、抗朊病毒、抗高血糖等多種顯著的生物活性，本實(shí)驗(yàn)在前期發(fā)現(xiàn)川芎總生物堿具有顯著抑制子宮平滑肌活性［6］的基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)該類(lèi)化合物具有緩解子宮平滑肌痙攣?zhàn)饔?，可為闡明川芎調(diào)經(jīng)之傳統(tǒng)功效提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 化合物1～3 對(duì)子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響Fig.1 Effects of compounds 1-3 on contractile activity of uterine smooth muscle