劉 釗，鐘菊迎，高爾寧，楊 鴻

（中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京 100700）

缺血性腦血管疾病約占腦血管疾病的80%［1］，其死亡率在人類疾病中居第二位［2］，腦缺血患者恢復血液灌注后腦組織損傷反而加重，出現(xiàn)更嚴重的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，稱為腦缺血再灌注損傷［3］（ischemia-reperfusion-induced cerebral injury，IRCI），腦缺血組織過量的炎癥反應是其重要發(fā)病機制［4］。梔子苷、川芎嗪和葛根素具有抑制多種炎性因子釋放、毛細血管擴張、白細胞游走等多方面的抗炎作用［5-8］，本實驗以三者為對象，對脂多糖引起RAW264.7 細胞過度炎癥反應的抑制作用為指標，篩選出最佳配伍，并在大鼠腦缺血再灌注損傷模型、體外凝血實驗中驗證其保護神經(jīng)血管單元、改善血液高凝狀態(tài)的作用。

1 材料

1.1 細胞與動物 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心；清潔級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK （京） 2012-0001。

1.2 試劑與藥物 川芎嗪 （純度99%，批號ZL201304014A）、梔子苷 （純度 99%，批號ZL201305026A）、葛根素 （純度 99%，批號ZL201304021A） 對照品購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。DMEM 高糖細胞培養(yǎng)基（貨號11965092）購自美國Gibco 公司；Hyclone 南美胎牛血清（貨號SV30087.01） 購自美國Thermo 公司；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH ＝7.4，不含微生物和內(nèi)毒素，貨號806552）、脂多糖 （Escherichia ColiO111∶B4，貨號L2630） 購自美國Sigma 公司；Bio-Plex ProTMMouse Cytokine 23-plex Assay （貨 號M60009RDPD） 購自美國Bio-Rad 公司；四氮唑紅（貨號30187792） 購自國藥集團化學試劑北京有限公司；凝血酶測試試劑盒（貨號130105）、凝血活酶（貨號130122）、部分凝血活酶（含氯化鈣溶液，貨號130110） 均購自復旦大學附屬華山醫(yī)院技協(xié)生物試劑公司。

1.3 儀器 Bio-Plex 200 液相蛋白芯片分析系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad 公司；中藥組分優(yōu)化軟件v1.0版，由中國中醫(yī)科學院中藥所楊洪軍研究員提供。

2 方法

2.1 藥品制備 在超凈臺中將梔子苷、川芎嗪、葛根素、脂多糖分別溶于高糖DMEM 培養(yǎng)液或PBS 溶液中，配制成1 g／L 或4 g／L，0.2 μm 注射器式過濾器過濾，分裝于1.5 mL 離心管中，保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。

2.2 中藥組分配伍劑量的確定 前期研究表明，梔子苷、川芎嗪、葛根素含有量分別低于400、200、400 g／L 時對細胞無明顯毒性。按照水平數(shù)應大于因素數(shù)2 倍的均勻設計原則，以梔子苷含有量（X1）、川芎嗪含有量（X2）、葛根素含有量（X3）作為考察因素，U9（93） 均勻設計表設置9 個水平，見表1。

表1 梔子苷、川芎嗪和葛根素給藥方案Tab.1 Regimens for gardenoside，ligustrazine and puerarin administration

2.3 細胞分組及處理 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中用含10% 胎牛血清、100 U／mL 青霉素、100 ng／L鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，每2～3 d 換液，將細胞分為對照組、LPS 模型組（1 ng／L）、中藥組分配伍組。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細胞進行實驗，棄去原有培養(yǎng)液，加入適量高糖DMEM 培養(yǎng)液，反復輕輕吹打制成含1×108／L 細胞的單細胞懸液，24 孔細胞板每孔接種1 mL 細胞懸液，培養(yǎng)24 h。分別向細胞板孔中加入相應配伍混合物，孵育4 h 后再加入LPS （1 ng／L），20 h后收集各組細胞培養(yǎng)上清液，凍存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

2.4 細胞因子水平檢測 細胞上清液在室溫下完全溶解后10 000 r／min 離心10 min，緩沖液按1∶10比例稀釋上清液。按照試劑盒說明書，于96孔檢測板上每孔加入50 μL 檢測磁珠，洗滌2 次，加入緩沖液、標準曲線樣品溶液、待檢測細胞上清液樣品溶液各50 μL，室溫避光振蕩（500 r／min）后搖床上孵育30 min，洗滌3 次，依次加入檢測抗體25 μL、Streptavidin-PE 熒光色素50 μL，操作同上，每孔用125 μL 緩沖液重懸微珠，放入Bio-Plex 200 液相蛋白芯片分析系統(tǒng)中讀取中位數(shù)熒光強度（median fluorescent intensity，MFI），并根據(jù)標準品的熒光強度檢測干擾素-γ （IFN-γ）、小鼠角化細胞源性細胞因子（KC）、核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、嗜酸細胞活化趨化因子（Eotaxin）、單巨噬細胞炎性蛋白-1α （MIP-1α）、巨噬細胞炎性蛋白-1β （MIP-1β）、受調(diào)節(jié)激活的正常T 細胞排泌的因子 （RANTES）、腫瘤壞死因子-α （TNFα）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF） 及白介素類因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12 （p40）、IL-12 （p70）、IL-13、IL-17 共23 種細胞因子水平，計算各復方對單個細胞因子的抑制率和對所有細胞因子的綜合抑制率，公式為單個細胞因子抑制率＝ ［（模型組細胞因子水平-復方組細胞因子水平）／模型組細胞因子水平］×100%、綜合抑制率＝ （16 種細胞因子抑制率之和／16） ×100%。

2.5 對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究

2.5.1 分組及給藥 適應性喂養(yǎng)3 d 后，45 只清潔級SD 大鼠隨機分為假手術組、模型組、預測最佳配伍組（梔子苷∶川芎嗪∶葛根素＝1∶4∶3，24 mg／kg）。手術前3 d 開始，大鼠每天皮下注射給藥1 次，假手術、模型組大鼠灌胃給予等體積的PBS 溶液。

2.5.2 模型建立 手術參照Zea Longa1［9］報道的大鼠大腦中動脈內(nèi)栓線阻斷法（MCAO） 并作適當改良。大鼠術前禁食12 h 后用10% 水合氯醛（400 mg／kg） 常規(guī)麻醉，分離左側(cè)頸總動脈，并顯露分叉處、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，游離頸外動脈，于近心端距分叉處4 mm 切口插入尼龍線，直視下進入頸內(nèi)動脈，長度約為（18±0.5） mm，直至大腦前動脈近端以完全阻斷大腦中動脈血供，缺血4 h再灌注時，輕柔回抽尼龍線至頸外動脈分叉處，恢復大鼠大腦中動脈供血；假手術組只是不插入尼龍魚線，其余步驟同上。在缺血期間及再灌注后，保持大鼠體溫（37±0.5）℃。

2.5.3 神經(jīng)功能評分 參照Zea Longa［9］報道進行評分。大鼠活動正常未觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀，為0 分；大鼠不能完全伸展腦缺血對側(cè)前肢（輕度），為1 分；大鼠行走時向腦缺血對側(cè)旋轉(zhuǎn)（中度），為2 分；大鼠自主運動時向腦缺血對側(cè)傾倒（重度），為3 分；大鼠不能自發(fā)行走，意識水平顯著降低（極重度），為4 分。

2.5.4 TTC 染色計算梗死灶與大腦體積比 大鼠于缺血4 h 再灌注20 h 后相應時間點處死，斷頭取腦，用腦切片器按2 mm 厚度在距額極1、3、5、7 mm處冠狀切開大腦，置于2% TTC 中，放入37 ℃溫箱中120 min，不時翻動腦片以使其均勻接觸到染色液，正常腦組織被染成紅色，壞死腦組織無法染色呈灰白色。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計算梗死面積，將各腦片梗死面積與厚度的乘積進行累加，獲得梗死體積，同法計算正常腦組織體積。梗死灶與大腦體積比＝ ［梗死灶體積／（梗死灶體積＋正常腦組織體積）］× 100%。

2.6 體外抗凝血活性測定 實驗室條件適應性喂養(yǎng)3 d 后，6 只清潔級SD 大鼠術前禁食12 h，10%水合氯醛常規(guī)麻醉后腹腔動脈取血，與3.8%枸櫞酸鈉液混合（1∶9），3 000 r／min 離心10 min。取上清血漿，在2 h 內(nèi)進行實驗。預測最佳配伍組（梔子苷∶川芎嗪∶葛根素＝1∶4∶3，4 mg／mL）、PBS 溶液組、肝素鈉組（100 U／mL） 分別與上清血漿按1∶4 比例混合后，使用半自動凝血儀測定各組的活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間、凝血酶原時間。

2.7 統(tǒng)計學分析 利用SPSS 13.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。應用“中藥組方優(yōu)化平臺”V1.0 軟件，采用多元線性回歸算法，獲得細胞因子綜合抑制率（Y） 與梔子苷含有量（X1）、川芎嗪含有量（X2）、葛根素含有量（X3） 的回歸方程。根據(jù)以上方程并結(jié)合實際進行人工優(yōu)化，最優(yōu)配伍組按“2.3”～ “2.4”項下方法進行驗證。

3 結(jié)果

3.1 配伍對細胞因子水平的影響 在正常RAW264.7 細胞中，各種細胞因子均呈低表達，經(jīng)LPS 刺激，RAW264.7 細胞表達大量的細胞因子（P＜0.05，P＜0.01），其中MIP-1α、MIP-1β、TNF-α 水平超過了Bio-Plex 200 液相蛋白芯片分析系統(tǒng)能檢測到的最高上限。配伍組7 對細胞因子的抑制作用最顯著，綜合抑制率最高，是唯一同時對IL-2、Eotaxin、IL-9 表達有抑制作用的（P＜0.05，P＜0.01），而配伍組7 能下調(diào)IL-1α、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、G-CSF、IFN-γ、KC 水平 （P＜0.05，P＜0.01），見表2。另外，配伍組1～9 的綜合抑制率分別為27.6%、22.9%、25.5%、23.2%、25.9%、25.4%、40.1%、31.6%、26.9%。

表2 各組RAW264.7 細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子水平的比較（ng／L，， n＝3）Tab.2 Comparison of cytokines levels in RAW 264.7 cell culture supernatant among all groups （ng／L，， n＝3）

表2 各組RAW264.7 細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子水平的比較（ng／L，， n＝3）Tab.2 Comparison of cytokines levels in RAW 264.7 cell culture supernatant among all groups （ng／L，， n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LPS 模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 數(shù)據(jù)驗證 應用中藥組分優(yōu)化軟件分析梔子苷、川芎嗪、葛根素含有量與細胞因子綜合抑制率（Y） 之間的量效關系，得到回歸方程為Y＝0.000 131 625 024 139 952＋0.000 593 434 987 332 954X1＋0.001 709 513 294 915 8X2＋0.000 452 116 715 964 787X3。結(jié)合實際進行人工優(yōu)化，獲得預測最佳配伍為梔子苷、川芎嗪、葛根素比例1∶4∶3。按“2.3”～“2.4”項下方法進行驗證試驗，測得最佳配伍的綜合抑制率為31.2%，高于配伍組7 的26.2%，與預期結(jié)果一致。

3.3 預測最佳配伍對腦缺血再灌注損傷的保護和體外抗凝血作用 缺血再灌注模型下，假手術組大鼠左右腦均染成紅色未見梗死灶，模型組大鼠左腦有明顯的灰白色梗死灶，最佳配伍組大鼠左腦灰白色腦梗死體積小于模型組（P＜0.05），各組大鼠右腦均未見灰白色梗死灶，最佳配伍組大鼠神經(jīng)癥狀評分優(yōu)于模型組（P＜0.05） （圖1、表3）。在體外抗凝血實驗中，與PBS 溶液組相比預測最佳配伍組平均凝血酶原時間、凝血酶時間延長（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

圖1 TTC 染色觀察各組大鼠腦梗死體積變化Fig.1 Observation of cerebral infarction volume change among all groups by TTC staining

表3 各組大鼠腦梗死體積和神經(jīng)行為評分比較（，n＝15）Tab.3 Comparison of cerebral infarction volumes and neurobehavioral dysfunction scores among all groups （， n＝15）

表3 各組大鼠腦梗死體積和神經(jīng)行為評分比較（，n＝15）Tab.3 Comparison of cerebral infarction volumes and neurobehavioral dysfunction scores among all groups （， n＝15）

注：與模型組比較，＃P＜0.05。

表4 各組體外血漿凝血酶時間的比較（， n＝3）Tab.4 Comparison of in vitro thromboplastin time among all groups （， n＝3）

表4 各組體外血漿凝血酶時間的比較（， n＝3）Tab.4 Comparison of in vitro thromboplastin time among all groups （， n＝3）

注：與PBS 溶液組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 討論

白細胞在腦缺血區(qū)浸潤聚集并釋放的多種炎性細胞因子、水解酶和活性氧簇所引起過度炎癥反應是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因，一方面誘發(fā)血栓形成造成微血管 “無復流”甚至再次阻斷［10-11］；另一方面，破壞血腦屏障會直接損失神經(jīng)元，造成局部腦組織壞死［12-13］。長期臨床及實驗研究證實，中藥及其有效成分在治療腦缺血再灌注損傷方面有很好的效果［14-16］，梔子苷、川芎嗪和葛根素具有減少多種炎性相關性因子的合成和釋放、抑制白細胞游走和微血管擴張、降低血壓、改善血液高凝狀態(tài)等作用［5-8］。

本研究以梔子苷、川芎嗪和葛根素為考察因素，采用均勻設計表U9 （93） 進行配伍劑量設計，對脂多糖誘導RAW264.7 細胞分泌細胞因子的抑制率為指標，研究三者配伍對白細胞過度炎癥反應的抑制作用，發(fā)現(xiàn)配伍后可不同程度地降低IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12（p40）、IL-12 （p70）、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、Eotaxin、MCP-1、RANTES 共16 種細胞因子的水平。對實驗結(jié)果采用綜合權重和多元線性回歸算法進行分析，結(jié)合人工優(yōu)化，篩選并驗證出梔子苷、川芎嗪和葛根素最佳配伍比例為1∶4∶3，可通過降低白細胞釋放，從而減少了T 細胞的活化、B 細胞的成熟、嗜酸性粒細胞和自然殺傷細胞的增殖，降低了抗體、前細胞因子、淋巴因子、急性期反應蛋白表達，抑制了單核細胞、巨噬細胞、粒細胞的趨化活性，減輕了缺血區(qū)的過度炎癥反應；通過抑制凝血因子活性來減少血栓形成，從而改善了微血管堵塞情況；通過保護腦缺血后恢復血流供應的MCAO 大鼠的神經(jīng)血管單元，從而減少了大腦梗死面積，提高了其生存質(zhì)量。

綜上所述，梔子苷、川芎嗪和葛根素合理配伍后能有效增強各組分降低炎癥級聯(lián)反應、促進腦部血流恢復的協(xié)同作用，從而保護了大腦血管神經(jīng)單元，減少了大腦半暗帶神經(jīng)組織的損傷，促進了神經(jīng)功能的修復。今后，將對配伍協(xié)同增效的機制及其基因之間的相互聯(lián)系、相互作用等作進一步研究，可有助于提高梔子苷、川芎嗪和葛根素的療效，使三者更好地服務于臨床。