李淑艷，烏云參丹，劉 燕，白玉霞，李淑紅，王玉華

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000； 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)護(hù)理學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000； 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）

巴特日-7 為蒙醫(yī)臨床常用的治療腸炎藥物，是由草烏葉、訶子、多葉棘豆、茜草、黑云香、銀朱、麝香7 味藥材組成的水丸制劑，具有殺粘、清熱解毒的功效，對(duì)瘟疫、麻疹、痘疹、腸痛、胸痛、白喉塞等疾病具有治療作用［1］，被《部頒標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》［2］收載，前期研究［3］表明其有效部位是乙酸乙酯、正丁醇部位。腸炎是由病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等引起的腸道疾?。?］，發(fā)病機(jī)制可分為急性、慢性。建立腸炎模型的方法以藥物型為主［5］，操作方法簡(jiǎn)便。本研究以巴特日-7 有效部位為對(duì)象，采用5%葡聚糖硫酸鈉建立腸炎模型大鼠，對(duì)該方抑制腸炎的作用進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD 大鼠，雄雌各半，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （遼） 2015-（0001）。

1.2 試劑與藥物 草烏葉、多葉棘豆，采自內(nèi)蒙古扎魯特旗自然保護(hù)區(qū)罕山，茜草、訶子、麝香、黑云香、銀朱購(gòu)自內(nèi)蒙古通遼市澤強(qiáng)藥業(yè)，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)布和巴特爾教授鑒定為正品。柳氮磺吡啶腸溶片（批號(hào)201606020，上海福達(dá)制藥有限公司）。葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS，批號(hào)0216011080，北京畢特博生物技術(shù)有限公司）；大便隱血檢測(cè)試紙條（批號(hào)2400458，上海源葉生物有限公司）；TNF-α ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170501A）、IL-1β ELISA 試劑盒 （批號(hào)E20170401A）、IL-10 ELISA 試劑盒 （批號(hào)E20170401A） 均購(gòu)自上海源葉生物有限公司。

1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1300，上海愛朗儀器有限公司）；電子天平（AUY120D，日本島津公司）；CO2培養(yǎng)箱（LabServ CO150，美國(guó)Thermo公司）；Sunrise 酶標(biāo)儀［帝肯（上海） 貿(mào)易有限公司］；倒置生物顯微鏡（日本Nikon 公司）；Histocentre3 包埋機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）。

2 方法

2.1 巴特日-7 不同提取部位的制備 按處方比例（草烏葉250 g、訶子250 g、茜草100 g、多葉棘豆100 g、黑云香100 g、銀朱50 g、麝香0.5 g） 稱取各單味藥材共7.5 kg，加入10 倍量95%乙醇回流提取3 次，每次4 h，合并提取液，減壓濃縮揮去溶劑，得到乙醇提取物，冷凍干燥揮去溶劑，用水懸浮后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，依次得到514.51 g 石油醚部位、372.01 g氯仿部位、602.25 g 乙酸乙酯部位、213.75 g 正丁醇部位、108.11 g 水殘余部位，提取率分別為6.86%、4.96%、8.03%、2.85%、1.44%。取上述乙酸乙酯、正丁醇部位（比例為1∶1） 的干浸膏適量，加水配制成0.296 g 生藥／mL。

按照處方比例稱取藥材共0.93 kg，加入10 倍量水煎煮1.5 h，藥渣加入8 倍量水煎煮1 h 后再加入6 倍量水煎煮0.5 h，合并濾液后濃縮，得到522.6 g 水提物，提取率為56.2%，加水配制成0.296 g 生藥／mL。

2.2 分組、造模及給藥 90 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（生理鹽水），模型組（5% DSS，1.0 g／kg），陽性對(duì)照組 （柳氮磺吡啶腸溶片，0.5 g／kg），巴特日-7 水提物低、中、高劑量組（0.45、0.90、1.80 g／kg） 及巴特日-7 有效部位低、中、高劑量組（0.45、0.90、1.80 g／kg），每組10 只，灌胃劑量20 mL／kg。除正常組外其余各組大鼠灌胃5% DSS 溶液（1.0 g／kg）建立腸炎模型，每天1 次，連續(xù)7 d，第4 天開始灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)7 d。

2.3 大鼠一般狀態(tài)評(píng)價(jià) 對(duì)大鼠精神狀態(tài)及活動(dòng)狀況、皮毛光滑度、肛周大便污染等進(jìn)行觀察，造模后每天上午9：00 給予飼料（50 g／只），第2 天上午9：00 稱定剩余的飼料質(zhì)量及大鼠體質(zhì)量。計(jì)算24 h 內(nèi)各組大鼠的平均攝食量，公式為平均攝食量＝ （飼料總質(zhì)量-飼料剩余質(zhì)量） ／大鼠體質(zhì)量。

2.4 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（disease activity index，DAI） 計(jì)算 給藥第4、7 天將各組大鼠置于單籠中，大便隱血檢測(cè)試劑條檢測(cè)便血情況［6］，并觀察2 h 內(nèi)排便情況，疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分＝ （體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)＋便血分?jǐn)?shù)＋大便性狀分?jǐn)?shù)） ／3。結(jié)果見表1。

2.5 大鼠結(jié)腸水腫程度評(píng)價(jià) 將各組大鼠處死后取結(jié)腸1 cm，濾紙將血液及表面水分吸干，電子天平稱定濕質(zhì)量，再于60 ℃烘箱中烘烤24 h，稱定干質(zhì)量，計(jì)算結(jié)腸濕／干質(zhì)量比［7］。

表1 DAI 評(píng)分Tab.1 DAI scores

2.6 ELISA 檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-10 水平 給藥第1、4、7 天從大鼠尾靜脈采血各0.5 mL，低溫3 500 r／min 離心20 min，分離血清，-20 ℃保存，對(duì)TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-10 水平進(jìn)行檢測(cè)，操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

2.7 HE 染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)狀態(tài) 末次給藥后大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，開腹取距離肛門6～8 cm 處結(jié)腸腸管1 cm，10%福爾馬林固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切成4 mm 厚度薄片，HE 染色，于顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)的變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠體質(zhì)量及攝食量的影響 正常對(duì)照組大鼠活動(dòng)敏捷，體質(zhì)量正常增加，皮毛光滑，無腹瀉，大便呈顆粒狀；模型組大鼠逐漸出現(xiàn)厭食，皮毛無光澤，體質(zhì)量減輕，肛周污染，可見稀便、糞便隱血為陽性；給藥組大鼠攝食量、體質(zhì)量均有不同程度的增加，稀便、血便也有不同程度的減輕。如表2～3 所示，給藥第3、6天巴特日-7 水提物、有效部位高劑量組體質(zhì)量較模型組增加（P＜0.05，P＜0.01）；第3、6 天巴特日-7 水提物、有效部位中、高劑量組24 h 攝食量較模型組增加（P＜0.05，P＜0.01）；水提物與有效部位體質(zhì)量、攝食量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠體質(zhì)量的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Bateri-7 on the body mass of enteritis model rats （， n＝10）

表2 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠體質(zhì)量的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Bateri-7 on the body mass of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表3 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠攝食量的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Bateri-7 on food intake of enteritis model rats （， n＝10）

表3 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠攝食量的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Bateri-7 on food intake of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.2 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠DAI 的影響 如表4 所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠DAI 升高（P＜0.05，P＜0.01）；給藥第3、6 天，巴特日-7水提物、有效部位高劑量組DAI 較模型組降低（P＜0.05，P＜0.01）；水提物與有效部位DAI 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠DAI 的影響（， n＝10）Tab.4 Effects of Bateri-7 on DAI of enteritis model rats （， n＝10）

表4 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠DAI 的影響（， n＝10）Tab.4 Effects of Bateri-7 on DAI of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠結(jié)腸水腫的影響如表5 所示，給藥7 d 后，巴特日-7 水提物、有效部位中、高劑量組結(jié)腸濕／干質(zhì)量比較模型組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠結(jié)腸水腫的影響（，n＝10）Tab.5 Effects of Bateri-7 on colon edema of enteritis model rats （， n＝10）

表5 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠結(jié)腸水腫的影響（，n＝10）Tab.5 Effects of Bateri-7 on colon edema of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.4 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 水平的影響 如表6～8 所示，給藥7 d 后與模型組比較，巴特日-7 水提物、有效部位中、高劑量組TNF-ɑ、IL-1β 水平降低，IL-10 水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；水提物與有效部位以上指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.5 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 如圖1 所示，正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，無水腫，上皮組織完好無損壞，未見炎癥細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)；模型組大鼠結(jié)腸水腫明顯增加，上皮結(jié)構(gòu)消失，腺體破壞，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)增加；巴特日-7 水提物、有效部位中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，水腫減輕，上皮結(jié)構(gòu)較完整；巴特日-7 水提物、有效部位低劑量組大鼠上述情況有輕微的好轉(zhuǎn)，但炎癥細(xì)胞較多，有大量的出血點(diǎn)。

表6 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠TNF-α 水平的影響（， n＝10）Tab.6 Effects of Bateri-7 on TNF-α level of enteritis model rats （， n＝10）

表6 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠TNF-α 水平的影響（， n＝10）Tab.6 Effects of Bateri-7 on TNF-α level of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表7 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠IL-1β 水平的影響（， n＝10）Tab.7 Effects of Bateri-7 on IL-1β level of enteritis model rats （， n＝10）

表7 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠IL-1β 水平的影響（， n＝10）Tab.7 Effects of Bateri-7 on IL-1β level of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表8 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠IL-10 水平的影響（， n＝10）Tab.8 Effect of Bateri-7 on IL-10 level of enteritis model rats （， n＝10）

表8 巴特日-7 對(duì)腸炎模型大鼠IL-10 水平的影響（， n＝10）Tab.8 Effect of Bateri-7 on IL-10 level of enteritis model rats （， n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

圖1 HE 染色觀察各組結(jié)腸組織病理學(xué)狀態(tài)（×100）Fig.1 Observation on the histopathological status of colon in each group by HE staining （× 100）

4 討論

巴特日-7 在蒙醫(yī)臨床上使用的劑型是水丸制劑［1］。本研究采用急性炎癥動(dòng)物模型，對(duì)巴特日-7水提物、有效部位（乙酸乙酯、正丁醇部位） 的抗炎作用進(jìn)行了探討。

葡聚糖硫酸鈉是一種硫酸化多糖類物質(zhì)，在結(jié)腸段局部可通過腸黏膜化學(xué)損傷而引發(fā)腸炎［8］，主要評(píng)價(jià)指標(biāo)是大鼠體質(zhì)量、24 h 攝食量、疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸濕／干質(zhì)量比、血清炎性細(xì)胞因子等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模7 d后與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量及24 h攝食量均下降，疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸濕／干質(zhì)量比增加，表明造模成功；灌胃DSS 與自由飲水相比，前者可控制大鼠給藥量、給藥時(shí)間等參數(shù)，并避免大鼠藥物吸收量不同引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

巴特日-7 是蒙醫(yī)臨床用于治療腸炎的常用經(jīng)典復(fù)方，相關(guān)研究報(bào)道已證實(shí)該方治療腸炎的作用［9-15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴特日-7 水提物、有效部位對(duì)DSS 致腸炎模型大鼠均表現(xiàn)出基本相同的作用，其體質(zhì)量、24 h 攝食量、疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸濕／干重量比均有顯著改善；HE 染色顯示，巴特日-7 水提物、有效部位低、中、高劑量組結(jié)腸黏膜上皮組織完整，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，水腫和充血明顯減輕，說明其對(duì)腸黏膜損傷均有修復(fù)作用；與模型組比較，巴特日-7 水提物、有效部位中、高劑量組疾病活動(dòng)指數(shù)有所降低，血清TNF-ɑ、IL-1β水平降低，IL-10 水平增加，具有一定的抑制腸炎作用。

巴特日-7 具有殺粘、清熱解毒功效，蒙醫(yī)臨床上將其用于主治瘟疫、腸刺痛等疾病是具有一定科學(xué)依據(jù)的［2］。該方主要含有生物堿［16］、有機(jī)酸［17］、黃酮［18］，目前課題組已從其有效部位中分離得到?jīng)]食子酸、鞣花酸［19］、苯甲酸、蘆丁、β-谷甾醇、槲皮素等成分，可能是抗炎的主要物質(zhì)，具體有待進(jìn)一步研究。