顧紅燕，韋元元，盧文超，張 磊，孫路路*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥學(xué)部，臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038； 2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，北京 100191； 3.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069）

白癜風(fēng)是一種常見的獲得性色素脫失性疾病，易診，難治［1-2］。中藥制劑祛白片1970 年成方，主要由蒺藜、制何首烏、黑芝麻、補(bǔ)骨脂、丹參、獨(dú)活等15 味中藥組成，以補(bǔ)養(yǎng)肝腎、養(yǎng)血祛風(fēng)的法則治療白癜風(fēng)，具有滋補(bǔ)肝腎，活血通絡(luò)的功效，臨床沿用至今［3-4］，療效穩(wěn)定可靠。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［5］已經(jīng)證實(shí)，祛白片可以促進(jìn)脫黑色素區(qū)域的黑色素色素島形成，色素島內(nèi)可見黑色毛發(fā)生長，高通量全基因芯片篩選結(jié)果顯示祛白片對(duì)小鼠6% 的基因轉(zhuǎn)錄有影響。由于目前多數(shù)研究者認(rèn)為自身免疫系統(tǒng)亢進(jìn)是白癜風(fēng)發(fā)病的主要病因［6］，因此本文根據(jù)前期研究結(jié)果，進(jìn)一步在細(xì)胞和分子水平上研究祛白片促黑色素形成和抗白癜風(fēng)的作用機(jī)制，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)制劑祛白片基礎(chǔ)藥理學(xué)研究資料不足。

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠B16 黑色素瘤（編號(hào)3111C0001CCC00 0324），購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.2 試劑與藥物 祛白片浸膏粉由北京世紀(jì)壇醫(yī)院制劑中心中藥制劑組自制，主要由蒺藜（炒）、制何首烏、黑芝麻（炒）、補(bǔ)骨脂、女貞子、北沙參等15 味中藥組成，批號(hào)為京藥制字Z20063383。將處方中15 味藥材加水煎煮3次，1 h／次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.25～130 （50 ℃） 稠膏，真空干燥成干浸膏，得率≥15%，粉碎制成棕褐色粉末狀浸膏細(xì)粉，內(nèi)在質(zhì)量控制方法批號(hào)為（2002） 京衛(wèi)藥制字［116］第F-2142 號(hào)，采用薄層色譜法進(jìn)行檢驗(yàn)，以供試藥品與對(duì)照品在相同位置上出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)判定為合格。陽性對(duì)照藥8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP，貨號(hào)M3501-1G）、過氧化氫（H2O2，貨號(hào)H1009，100 mL）、左旋多巴 （貨號(hào)V900425） 均購自美國Sigma 公司；TRNzol 總RNA 提取試劑（貨號(hào)DP405-02） 購自天根生化科技（北京） 有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （貨號(hào)RR047B）、SYBR?Premix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus）、ROX plus （貨號(hào)RR82LR）、DNA Marker （貨號(hào)3427Q） 均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司；CD4 兔多抗（貨號(hào)sc-7219，1∶500）、CD8 兔多抗（貨號(hào)sc-7188） 購自美國Santa cruz 公司；GAPDH 鼠單抗 （貨號(hào)YM3029，1∶20 000） 購自美國Immunoway 公司；引物合成由美國Invitrogen公司完成。

2 方法

2.1 藥物與試劑的配制 祛白片溶液：稱取0.1 g 祛白片粉末，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)液溶解至10 mL，0.22 μm 濾膜過濾，樣品合格判定標(biāo)準(zhǔn)同內(nèi)在質(zhì)量控制方法，采用薄層色譜法進(jìn)行檢驗(yàn)；取經(jīng)過處理后的祛白片溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾并濃縮后作為供試品溶液，另取補(bǔ)骨脂素等相同處理成對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于硅膠G 薄層板上，最終結(jié)果以供試藥品與對(duì)照品相同位置上出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)判定為合格樣品。H2O2溶液：取102.1 μL H2O2原液，加入897.9 μL 培養(yǎng)液，配制成1 mol／L，用培養(yǎng)液稀釋到0.1 mmol／L。8-MOP 溶液：取0.216 2 g 8-MOP，加入DMSO 溶解至10 mL，配制成0.1 mol／L，分裝-20 ℃保存，使用時(shí)，采用無血清DMEM 稀釋至所需濃度備用。L-多巴溶液：取1 gL-多巴溶于100 mL PBS 溶液中，磁力攪拌器溶解，配制成10 g／L。

2.2 小鼠黑色素瘤B16 脫黑色素細(xì)胞模型建立 制備B16細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)液（10% FBS、DMEM、1% P／S） 稀釋細(xì)胞。96 孔板鋪板，每孔10 000 個(gè)細(xì)胞，5個(gè)重復(fù)；24 孔板，每孔100 000 個(gè)細(xì)胞，4 個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后更換含0.1 mmol／L H2O2的培養(yǎng)液，與細(xì)胞共同孵育4 h［7］，吸棄培養(yǎng)基，即得脫黑色素細(xì)胞。

2.3 光鏡下觀察小鼠B16 黑色素細(xì)胞生長狀態(tài) 分為模型組、溶媒組、8-MOP 組（25、50、100 μmol／L）、祛白片組（25、50、100 μg／mL），模型組細(xì)胞造模后加入相同體積的培養(yǎng)基，后續(xù)實(shí)驗(yàn)與其他組平行；由于8-MOP 由DMSO 溶解配制所得，因此設(shè)DMSO 溶媒組，原液稀釋1 000 倍，其余操作與實(shí)驗(yàn)組平行；陽性對(duì)照組（25、50、100 μmol／L）、祛白片組（25、50、100 μg／mL） 分別加入對(duì)應(yīng)藥物。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，倒置顯微鏡下觀察脫黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并光鏡下拍照。

2.4 CCK-8 檢測(cè)小鼠B16 黑色素瘤細(xì)胞存活 取對(duì)數(shù)生長期B16 細(xì)胞，胰酶消化，以細(xì)胞濃度為1×104／孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法建立脫黑色素細(xì)胞模型，分組同“2.3”項(xiàng)下，另設(shè)本底對(duì)照組，為不含細(xì)胞的本底，僅加入培養(yǎng)基。每組設(shè)5 復(fù)孔，加入相應(yīng)藥物處理24、48 h，吸去上清，加入CCK-8 （CCK-8∶DMEM＝1∶10） 溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處光密度（OD），細(xì)胞存活率＝ ［（OD給藥組-OD本底對(duì)照組） ／ （OD溶媒組／模型組-OD本底對(duì)照組）］×100%［8］，祛白片組細(xì)胞存活率計(jì)算與模型組比較，8-MOP 組與溶媒組比較。

2.5 黑素形成率測(cè)定 用1 mol／L NaOH 裂解法［9］檢測(cè)，分組同“2.3”項(xiàng)下，加入相應(yīng)藥物處理24、48 h，去除上清液，PBS （pH ＝7.4） 洗2 次，加入200 μL 含10%DMSO 的NaOH 溶液（1 mol／L），80 ℃恒溫水浴保溫2 h，充分裂解細(xì)胞和溶解黑素顆粒，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處光密度（OD），黑素形成率＝ ［（OD給藥組-OD溶媒組／模型組） ／OD溶媒組／模型組］×100%。祛白片組促黑色素生成計(jì)算與祛白片模型相比較，8-MOP 組計(jì)算與溶媒組比較。

2.6 酪氨酸酶活性測(cè)定 96 孔板接種人黑色素細(xì)胞，分組同“2.3”項(xiàng)下，加入相應(yīng)藥物處理24、48 h，棄去培養(yǎng)液，PBS （pH＝7.4） 洗滌2 次，每孔加入1% Triton X-100溶液90 μL，迅速放入-80 ℃冰箱內(nèi)30 min，隨后室溫融化使細(xì)胞完全破裂，37 ℃預(yù)溫后加入10 g／LL-DOPA 溶液（100 μL／孔），37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度值 （OD）［10］，酪氨酸酶活性促進(jìn)率＝ ［（OD給藥組-OD溶媒組／模型組） ／OD溶媒組／模型組］×100%，正值代表促進(jìn)酪氨酸酶活性，負(fù)值為抑制酪氨酸酶活性。祛白片組酪氨酸酶活性促進(jìn)率計(jì)算與祛白片模型組比較，8-MOP 組計(jì)算與其溶媒組比較。

2.7 RT-PCR 檢測(cè) 各組細(xì)胞分別放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后，采用TRNzol 總RNA 提取試劑進(jìn)行樣本RNA 提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書操作，并采用紫外吸收測(cè)定法檢測(cè)RNA 濃度和純度，mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70 ℃短暫保存?zhèn)溆?。引物序列，CD4 正向5′-GCACAGCTATCACGGCCTAT-3′，反向5′-TTGAGGTCTTTGGTGGACTTTT-3′，190 bp；CD8 正向5′-AGGGGACCGGATTGGACT-3′，反 向 5′-GTGCCATTTTACACAATTTTCTC-3′，199 bp；β-actin 正向5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，反向5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，150 bp。反應(yīng)條件為95 ℃、10 s；95 ℃、5 s，55 ℃、20 s，72 ℃、6 s，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃、1 min，55 ℃、30 s，95 ℃、30 s。采用2-ΔΔct法計(jì)算出各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2.8 Western blot 檢測(cè) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量，-70 ℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE 電泳，采用凝膠成像儀進(jìn)行成像，同時(shí)檢測(cè)各條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（） 表示，重復(fù)3 次。若方差齊性，則選用LSD法；若方差不齊，則選用Dunnett T3 法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 祛白片對(duì)黑色素細(xì)胞生長的影響 由圖1 可見，祛白片隨著作用時(shí)間和劑量的增加，細(xì)胞數(shù)逐漸增加；作用48 h后，祛白片對(duì)脫黑色素細(xì)胞促生長作用最明顯，8-MOP 給藥24、48 h 后，對(duì)脫黑色素細(xì)胞的促生長作用與祛白片較為類似。

圖1 祛白片對(duì)脫黑色素細(xì)胞生長的影響（×100）

3.2 祛白片對(duì)黑色素細(xì)胞增殖的影響 如圖2 所示，祛白片25、50、100 μg／mL 給藥24、48 h 后，細(xì)胞存活率逐漸增加，其中50 μg／mL 給藥48 h 后為107.33%，100 μg／mL給藥48 h 后為114.71%；100 μmol／L 8-MOP 作用于脫黑色素細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率為119.06%。

圖2 祛白片對(duì)黑色素細(xì)胞生長活性的影響

3.3 祛白片對(duì)黑色素形成的影響 如圖3 所示，50、100 μg／mL祛白片給藥24 h 后，促黑色素生成率分別為38.27%、48.44%，100 μg／mL 給藥48 h 后為11.79%；100 μmol／L 8-MOP 給藥24 h 后促黑色素生成率為11.21%，48 h 后為29.83%。

3.4 祛白片對(duì)酪氨酸酶活性影響 由圖4 所示，50 μg／mL祛白片作用于脫黑色素細(xì)胞24 h 后酪氨酸酶活性促進(jìn)率為6.92%，25 μg／mL 作用48 h 后為23.37%，100 μg／mL 作用24 h 后為-27.17%，呈抑制作用。

圖3 祛白片對(duì)促黑色素生成率的影響

圖4 祛白片對(duì)酪氨酸酶活性的影響

3.5 祛白片對(duì)脫黑色素細(xì)胞免疫通路mRNA 表達(dá)的影響 如表1 所示，祛白片作用于脫黑色素細(xì)胞48 h 后，可促進(jìn)CD4 基因轉(zhuǎn)錄，抑制CD8 基因轉(zhuǎn)錄 （P＜0.01）；100 μmol／L 8-MOP 作用于脫黑色素細(xì)胞后，可促進(jìn)CD4 基因轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）。

表1 祛白片對(duì)CD4、 CD8 mRNA 表達(dá)的影響（， n＝3）

表1 祛白片對(duì)CD4、 CD8 mRNA 表達(dá)的影響（， n＝3）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 祛白片對(duì)脫黑色素細(xì)胞免疫通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如表2、圖5 所示，100 μg／mL 祛白片作用于脫黑色素細(xì)胞48 h 后，可促進(jìn)CD4 蛋白表達(dá)（P＜0.05），抑制CD8蛋白表達(dá)（P＜0.01）；100 μmol／L 8-MOP 作用48 h 后，也可促進(jìn)CD4 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

表2 祛白片對(duì)CD4、CD8 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

表2 祛白片對(duì)CD4、CD8 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖5 Western blot 檢測(cè)CD4、CD8 蛋白表達(dá)

4 討論

本研究首先觀察祛白片對(duì)脫黑色素細(xì)胞生長的影響，結(jié)果表明，祛白片作用細(xì)胞后可隨著劑量和作用時(shí)間增加而逐漸促進(jìn)黑色素細(xì)胞的生長。在對(duì)黑色素生成的影響上，與模型組相比，祛白片（50、100 μg／mL） 給藥24 h 后可顯著增加黑色素形成，進(jìn)一步研究祛白片對(duì)黑色素合成路徑中限速酶酪氨酸激酶活性的影響，結(jié)果表明，50 μg／mL祛白片作用于細(xì)胞24 h，以及25 μg／mL 作用于細(xì)胞48 h時(shí)可促進(jìn)酪氨酸酶活性，而100 μg／mL 作用24、48 h 時(shí)沒有促進(jìn)作用，反而呈現(xiàn)明顯的抑制作用，表現(xiàn)為雙向性調(diào)節(jié)作用；8-MOP 未出現(xiàn)此現(xiàn)象，50、100 μmol／L 下表現(xiàn)為促進(jìn)酪氨酸酶的作用。中藥雙向調(diào)節(jié)作用是指同一中藥及其組成的方劑，在機(jī)體不同狀態(tài)下或以不同的方式應(yīng)用，可以發(fā)揮出趨向相反的作用［11］，因素有很多，如中藥本身、中藥炮制過程、中藥不同部位、劑量等［12］。劉錚等［13］2008年發(fā)表的綜述中提到有些復(fù)方或單味中藥對(duì)黑色素和酪氨酸活性的影響呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制可能與給藥劑量有關(guān)，但是尚有爭(zhēng)議，復(fù)方制劑的雙向調(diào)節(jié)作用還有可能與配伍、提取方式、產(chǎn)地、提取方式等有關(guān)系?？傮w來講，祛白片可促進(jìn)脫黑色素細(xì)胞生長，高劑量情況下作用于脫黑色素細(xì)胞24 h 可促進(jìn)黑色素形成，對(duì)酪氨酸酶活性呈現(xiàn)雙向性調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)酪氨酸激酶活性，高劑量抑制該酶活性。

有研究表明T 細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)參與了白癜風(fēng)的發(fā)病和發(fā)展，尤其是在CD8＋T 細(xì)胞中，被認(rèn)為可以直接破壞黑素細(xì)胞，輔助性T 細(xì)胞，主要是CD4＋T 細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)或協(xié)助免疫反應(yīng)，促進(jìn)白癜風(fēng)皮損的改善［14］。白癜風(fēng)患者細(xì)胞免疫在一定程度上呈抑制狀態(tài)［15］，有學(xué)者研究顯示白癜風(fēng)患者CD4＋比例顯著降低，CD8＋比例顯著升高［16-17］，因此本研究進(jìn)一步探討了祛白片對(duì)CD4、CD8 蛋白及基因表達(dá)的影響。由于在黑色素細(xì)胞生長、黑色素形成、酪氨酸酶活性3 個(gè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶媒組與模型組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中未再設(shè)溶媒組，陽性對(duì)照組結(jié)果直接與模型組相比較。結(jié)果表明，高劑量祛白片作用于脫黑色素細(xì)胞48 h 后可促進(jìn)CD4 基因轉(zhuǎn)錄，抑制CD8 基因轉(zhuǎn)錄；8-MOP 高劑量組（100 μmol／L） 作用于脫黑色素細(xì)胞后也可顯著促進(jìn)CD4 基因轉(zhuǎn)錄，而對(duì)CD8影響小。祛白片蛋白表達(dá)的研究也得到了相似的結(jié)果；100 μmol／L 8-MOP 可增強(qiáng)CD4 蛋白表達(dá)，抑制CD8 蛋白表達(dá)，對(duì)CD4 的作用更顯著。綜上所述，祛白片可以促進(jìn)黑色素合成，可能是通過影響自身免疫路徑中的CD4、CD8蛋白及基因表達(dá)起作用。