孫 偉，許桂鳳，唐小杭，谷穎敏，章 鑫，謝家駿，顧勝華

（上海中醫(yī)藥大學創(chuàng)新中藥研究院，上海 201203）

高脂血癥是當今社會一種很常見的慢性疾病，可引起多種嚴重危害人體健康的疾病，如脂肪肝、動脈粥樣硬化、冠心病、下肢動脈閉塞等［1］。目前，臨床上預防和治療高血脂的藥物主要是他汀類、貝特類，雖然治療效果較好，但存在肝腎損傷、肌肉損害等不良反應，天然產(chǎn)物具有毒副作用低等優(yōu)點，正成為人們關注和研究的熱點［2-3］。人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，生物活性廣泛，人參皂苷是其主要有效成分，臨床和動物實驗證實其具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗疲勞、保護心腦血管等多種藥理作用［4-5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re、Rg1、Rg3、Rh1 等有一定的降脂作用［6-7］，但其機制目前尚不明確，而且口服生物利用度低，體內(nèi)的濃度遠遠低于體外機制研究中的濃度［8］。因此，本實驗將對該成分對高脂血癥小鼠的降脂作用進行初步研究。

1 材料

1.1 動物 雄性C57BL／6 小鼠，SPF 級，體質量18～22 g，購自斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK （滬） 2017-0005，飼養(yǎng)于SPF 級動物房，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度（55±15）%，換氣次數(shù)10～20 次／h。人工控制照明，晝夜交替時間為12 h ／12 h。

1.2 藥物 人參總皂苷由吉林大學提供，含有量分別為Rb1 16.6%、Rb2 11.53%、Rc 9.9%、Rd 6.8%、Re 7.6%、Rg1 3.3%、Rg2 0.98%、Rf 1.4%。辛伐他汀［華中海威（北京） 基因科技有限公司，純度＞99%］。

1.3 試劑 普通飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司；42%高脂飼料購于帆泊生物技術有限公司。

1.4 儀器 日立7080 全自動生化分析儀（日本日立貿(mào)易有限公司）；2-16K 冷凍離心機（美國Sigma公司）；AR2130 電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；BX51 顯微鏡（日本奧林巴斯光學株式會社）；全能型脫水機（德國徠卡公司）；FastPrep?快速核酸提取儀（美國Qbiogene 公司）；遺傳分析儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）。

2 方法

2.1 人參總皂苷對高脂小鼠的降脂作用 小鼠在SPF 級飼養(yǎng)室適應性飼養(yǎng)3 d，按體質量分層，隨機區(qū)組分為正常對照組、高脂模型組、人參總皂苷低劑量組、人參總皂苷中劑量組、人參總皂苷高劑量組、陽性對照組，每組10 只，每籠5 只。除正常對照組給予普通飼料外，其他組均為高脂飼料，高脂飼料喂養(yǎng)2 周后開始給藥，每天灌胃1 次；各組給藥劑量分別為低劑量組人參總皂苷100 mg／kg，中劑量組人參總皂苷200 mg／kg、高劑量組人參總皂苷400 mg／kg，陽性對照組辛伐他定20 mg／kg，正常對照組、高脂模型組純水，連續(xù)4 周，每周稱定體質量1 次。實驗結束前1 d 收集糞便，置于-80 ℃下保存待測。在實驗末期小鼠禁食12 h，異氟烷麻醉后經(jīng)下腔靜脈采血、離心，進行血清生化學檢查，取出肝臟，稱定質量，4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進行組織病理學檢查。

2.2 小鼠糞便細菌群落結構研究 取正常對照組、高脂模型組、人參總皂苷低劑量組、人參總皂苷中劑量組、人參總皂苷高劑量組小鼠糞便，采用Fast DNA 快速提取試劑盒提取其中微生物的基因組總DNA。用通用引物8F 和1492R 作為引物擴增細菌16 s rDNA，其中正向引物8F 的5′端用羧基熒光素（6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM） 標記，PCR 反應的程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，運行25 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對純化后的熒光PCR 產(chǎn)物用RsaⅠ進行限制性酶切，酶切反應在37 ℃溫育12 h，產(chǎn)物脫鹽干燥后用10 μL 超純?nèi)ルx子甲酰胺溶解，加入0.3 μL Liz 內(nèi)標混合均勻，進行毛細管電泳和檢測，上樣體積為10 μL，電泳主要條件為毛細管進樣電壓為30 kV；進樣持續(xù)時間為40 s。

2.3 RT-PCR 檢測腸道細菌 本實驗對幾個特定的細菌組分16S rDNA 進行定量PCR，其中8F、518R 作為總體細菌的16S rDNA 的引物，其余各對引物都只能特定擴增某個特定的細菌的群體。用相應的質粒制作每個基因的標準曲線，計算樣品中的拷貝數(shù)，每個特定的微生物16S rDNA 拷貝數(shù)除以總細菌的拷貝數(shù)，即為該類細菌的含有量（%）。引物序列分別為總細菌正向5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向5′-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3′；Lactobacillus 正向5′-AGCAGTAGG GAATCTTCCA-3′，反向5′-ATTYCACCGCTACACATG-3′；Clostridiumcluster ⅪⅤ正向5′-GAWGAAGTATYTCGGTATG-3′，反向5′-CTACGCWCCCTTTACAC-3′，用特異性的引物PCR 擴增相對應的細菌16S rDNA，PCR 產(chǎn)物與pGEM-T-easy 載體連接后，轉化到感受態(tài)細胞（E.coliDH5α 細胞） 內(nèi)。轉化子提取質粒，經(jīng)測序后證實為該類細菌的16S rDNA后即為標準質粒，按照其DNA 的分子量和濃度計算拷貝數(shù)，10 倍稀釋7 個梯度（1×102～1×108） 制作標準曲線，每個梯度3 個重復，同時作3 個空白對照，進行PCR 反應。

2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0 軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。利用SIMCA-P14 軟件對小鼠腸道菌群的T-RFLP 數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，實驗樣本首先作為觀察變量，內(nèi)標標準化的峰面積作為響應變量建立數(shù)據(jù)矩陣，偏最小二乘判別式分析（PLS-DA） 進行數(shù)據(jù)降維，以主成分描述組間或樣本間最大的差異。

3 結果

3.1 人參總皂苷對高脂飼料喂養(yǎng)小鼠體質量的影響 從表1 可以看出，小鼠飼養(yǎng)2 周高脂飼料后，與正常對照組比較其體質量增加（P＜0.05）。第3～6 周，正常對照組小鼠體質量增長最少，高脂模型組最多；人參總皂苷組與高脂模型組比較，小鼠體質量都有下降趨勢，并且呈劑量依賴性。

表1 人參總皂苷對小鼠體質量的影響（， n＝10）Tab.1 Effects of total ginsenosides on body mass of hyperlipidemic mice （， n＝10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與高脂模型組比較，△P＜0.05。

3.2 人參總皂苷對高脂飼料喂養(yǎng)小鼠血脂及肝功能的影響 從圖1 可以看出，高脂模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平均高于正常對照組（P＜0.05），而人參總皂苷、辛伐他汀均能抑制TC、TG、LDL-C 水平（P＜0.05），并呈劑量依賴性。給藥4 周后，人參總皂苷低、中、高劑量分別使小鼠血清TC 水平降低了16.69%、25.86%、30.32%，TG 水平降低了20.49%、35.35%、38.39%，LDL-C水平降低了18.96%、32.26%、40.97%。人參總皂苷灌胃給藥4 周后，對小鼠ALT、AST 水平及肝功能無影響，見圖2。

3.3 人參總皂苷對高脂飼料喂養(yǎng)小鼠肝細胞脂肪變性的影響 正常對照組小鼠肝臟可觀察到肝組織細胞結構正常，排列整齊；高脂模型組小鼠肝臟組織細胞則發(fā)現(xiàn)比較明顯的脂肪變性，形成大小不等的空泡狀脂滴；人參總皂苷能改善高脂飼料引起的肝臟脂肪變性，見圖3。

3.4 人參總皂苷對小鼠腸道菌群的作用 從圖4可以看出，正常對照組、高脂模型組小鼠腸道菌群的差異較大；人參總皂苷組小鼠腸道菌群結構更接近于正常對照組，尤其是高劑量組。

3.5 人參總皂苷對小鼠腸道細菌的影響 從圖5可以看出，高脂模型小鼠腸道細菌不但在群落結構上與正常對照組比較存在差異，在數(shù)量上亦然；高脂模型組的腸道細菌數(shù)量高于正常對照組（P＜0.05），而人參總皂苷能逆轉這種現(xiàn)象，并且呈劑量依賴性。在細菌相對豐度上，產(chǎn)丁酸的Clostridiumcluster ⅩⅣ和益生菌Lactobacillus 在高脂模型動物中減少（P＜0.05），而給予人參總皂苷后兩者豐度增加，高劑量下可恢復到正常對照組水平。

4 討論

由于生活方式、飲食結構的改變，高脂血癥的發(fā)生率逐漸上升，已經(jīng)成為嚴重危害人體健康的因素，可誘發(fā)動脈粥樣硬化、脂肪肝等多種疾病，因此，安全有效地控制血脂具有非常重要的意義。目前，臨床上他汀類藥物仍然作為高脂血癥的首選，能競爭性抑制細胞內(nèi)膽固醇合成早期過程中限速酶的活性，抑制膽固醇的生物合成，但長期服用會引起肝腎功能損害、肌肉酸痛等不良反應［9］。

圖3 HE 染色觀察各組小鼠肝組織病理改變（×200）Fig.3 Observation of hepatic pathological changes of mice in each group by HE staining （×200）

圖4 各組小鼠腸道細菌群落結構PLS-DA 散點圖Fig.4 PLS-DA scatter plot for structure of mice gut microbiota in each group

圖5 各組腸道細菌相對豐度（n＝6）Fig.5 Relative abundance of intestinal bacteria in each group （n＝6）

人參皂苷是補脾益腎中藥人參的主要成分，具有抗疲勞、提高機體免疫力等多種作用，多個單一成分的人參皂苷已在研究中證實有良好的降脂作用，而總皂苷的降脂作用則鮮有報道。此外，人參皂苷Rg1 口服生物利用度僅為2.58%［8］，人參皂苷Rb1 的生物利用度1%左右，Rg1 在大鼠體內(nèi)的達峰濃度（Cmax） 為10.56 μg／mL，而人參皂苷Rg3 在Beagle 犬體內(nèi)Cmax僅為7.3 ng／mL［10］，人參皂苷Re 更低，為0.939 μg／mL，藥物在血液中的最高濃度遠遠達不到（不及2%） 關于人參皂苷體外降脂作用機制論文中的（＞500 μg／mL）。目前，體外實驗提出的作用機制尚不能完全解釋人參皂苷口服給藥的藥效作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群結構的改變與糖尿病［11］、肥胖［12］、脂肪肝［13］等有密切關系。本研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷具有較好的降脂作用，而在對腸道菌群研究則發(fā)現(xiàn)正常對照組和高脂模型小鼠腸道菌群的差異較大，人參總皂苷給藥后，小鼠腸道菌群結構更接近于正常對照組，尤其是高劑量給藥組，提示腸道細菌可能是人參總皂苷的作用靶點。Cani 等［14］報道，高脂飼料改變了小鼠的腸道菌群結構，內(nèi)毒素進入體內(nèi)可引起低度的慢性炎癥，從而導致小鼠出現(xiàn)肥胖、高脂、胰島素抵抗等代謝損傷；本研究發(fā)現(xiàn)，高脂小鼠的腸道細菌總量高于正常對照組，細菌總量的增多可能也是代謝內(nèi)毒素進入體內(nèi)的一個重要因素，而人參總皂苷可以逆轉這個變化，即可能作用于腸道菌群，降低細菌數(shù)量，減少代謝內(nèi)毒素。細菌總量在高脂模型動物中明顯升高，但產(chǎn)丁酸的Clostridium clusterⅩⅣ［15］、益生菌Lactobacillus的比例明顯減少。丁酸是由結腸內(nèi)厭氧菌利用低聚糖、非淀粉多糖、抗性淀粉等未消化碳水化合物發(fā)酵的產(chǎn)物，為腸上皮細胞的重要能量來源，而人體本身不產(chǎn)生丁酸，Clostridium cluster ⅩⅣ的減少則可引起其降低，導致腸上皮屏障功能失衡，增加細菌內(nèi)毒素進入體內(nèi)。本研究初步發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷可能從改變腸道菌群的結構和數(shù)量來發(fā)揮降脂作用。