宋 歌，董 彪，朱照偉

1)安陽市人民醫(yī)院泌尿外科 河南安陽 455000 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450052

膀胱癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤致死的第二大原因[1]；近年來，膀胱癌的常規(guī)和靶向治療策略取得了一定進(jìn)展，但患者的5 a生存率仍較低，且膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確[2-3]。因此，迫切需要開展膀胱癌的分子機(jī)制研究，為膀胱癌的診斷和治療尋找新的生物標(biāo)志物。微小RNA(microRNA,miR)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA。研究[4]顯示，miR參與癌癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。miR-130a-3p在多種腫瘤中表達(dá)異常[5-6]，miR-130a-3p過表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[7]。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖1(Sparc/osteonectin, cwcv, and kazal-like domains proteoglycan 1, SPOCK1)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[8]，下調(diào)其表達(dá)對肺癌、膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移具有抑制作用[9-10]。本研究擬探討miR-130a-3p對膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響以及miR-130a-3p與SPOCK1的靶向關(guān)系，以進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為尋找膀胱癌潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞5637購自美國ATCC公司，DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Lipofectamine 2000購自美國賽默飛世爾有限公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液購自北京索萊寶公司，SPOCK1、β-actin、MMP-2、Caspase-3抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自武漢博士德生物有限公司，Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，miR-130a-3p mimics、miR-con、si-SPOCK1、si-con、anti-miR-con和anti-miR-130a-3p購自上海吉瑪公司。ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.2臨床樣本收集與細(xì)胞培養(yǎng)9例膀胱癌組織及癌旁正常組織來源于安陽市人民醫(yī)院泌尿外科因膀胱癌接受手術(shù)治療的患者，患者術(shù)前未接受過化療、放療等治療，病理學(xué)診斷為膀胱癌。癌旁組織距離癌組織≥3 cm。樣本切除后立即置于液氮中凍存。

SV-HUC-1細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，5637細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長密度約為80%時，加入適量胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以下細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3不同組織和細(xì)胞中miR-130a-3p和SPOCK1mRNA表達(dá)的檢測提取上述組織和細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-130a-3p上游引物序列為5’-GATGCTCTCAGTGCAATGTTA-3’，下游引物序列為5’-CTCTGTCTCTCGTCTTGTTGGTAT-3’；SPOCK1上游引物序列為5’-CCCGTTACTGCCGGTGATTA-3’，下游引物序列為5’-CCAGGTCTGGACAAGCTGAG-3’； U6(內(nèi)參)上游引物序列為5’-ATTGGAACGAT ACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。以合成的cDNA為模板，置實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min，40個循環(huán)后檢測擴(kuò)增曲線和熔解曲線，記錄Ct值，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.4不同組織和細(xì)胞中SPOCK1蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法檢測。在組織或細(xì)胞中加入RIPA裂解液充分裂解，提取總蛋白，加緩沖液置沸水中煮5 min，進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，常溫下用50 g/L 脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入SPOCK1一抗(稀釋度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，隨后用TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光，以目的條帶和β-actin條帶灰度值的比值為SPOCK1蛋白的相對表達(dá)量。

1.5轉(zhuǎn)染miR-130a-3p和沉默SPOCK1對5637細(xì)胞生物學(xué)行為及MMP-2、Caspase-3表達(dá)的影響

1.5.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染效率評估 調(diào)整5637細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，待細(xì)胞生長至70%融合時開始轉(zhuǎn)染。參照Lipofectamine 2000試劑說明書，將miR-130a-3p mimics(miR-130a-3p組)、miR-con、si-SPOCK1以及si-con轉(zhuǎn)染入5637細(xì)胞，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)4～6 h，更換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)備用。同時設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照組。用qRT-PCR檢測空白對照組、miR-130a-3p組和miR-con組細(xì)胞中miR-130a-3p的表達(dá)(方法同1.3)，用Western blot法檢測空白對照組、si-SPOCK1組和si-con組細(xì)胞中SPOCK1蛋白的表達(dá)(方法同1.4)，以評估轉(zhuǎn)染效率。

1.5.2 細(xì)胞存活率檢測 收集轉(zhuǎn)染后的5637細(xì)胞，用PBS沖洗3次，棄上清液，加入胰蛋白酶消化，之后將細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔加入100 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃搖床孵育10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=[(待測組A值-調(diào)零孔A值)/(空白孔A值-調(diào)零孔A值)]×100%。

1.5.3 細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測 收集轉(zhuǎn)染后的5637細(xì)胞，更換為無血清培養(yǎng)基，饑餓處理12 h。將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基充分混合，加入Transwell上室，37 ℃靜置3～4 h后將細(xì)胞制成5×105個/mL的細(xì)胞懸液，吸取100 μL接種于上室，下室加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。37 ℃培養(yǎng)48 h，用無菌棉簽擦去多余細(xì)胞和Matrigel膠，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察，記錄侵襲細(xì)胞數(shù)。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell上室不加入Matrigel膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 細(xì)胞凋亡檢測 使用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的5637細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，加入500 μL Annexin V緩沖液重懸細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至EP管，每管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合，室溫避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5.5 MMP-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測 收集轉(zhuǎn)染后的5637細(xì)胞，采用Western blot法檢測MMP-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)，具體操作同1.4。MMP-2、Caspase-3一抗均按1∶1 000稀釋。

1.6miR-130a-3p與SPOCK1靶向關(guān)系的驗(yàn)證運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)對miR-130a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p和SPOCK1的3’UTR存在部分堿基互補(bǔ)。構(gòu)建含有miR-130a-3p結(jié)合位點(diǎn)的SPOCK1-3’UTR野生型(WT)及突變型(MT)報告基因載體，并分別與miR-130a-3p mimics或miR-con共轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書的指示測定熒光素酶活性。進(jìn)一步將5637細(xì)胞分為4組：miR-con組、miR-130a-3p組、anti-miR-con組和anti-miR-130a-3p組，分別轉(zhuǎn)染miR-con、miR-130a-3p mimics、anti-miR-con和anti-miR-130a-3p，方法同1.5。收集4組細(xì)胞，采用Western blot法檢測SPOCK1蛋白的表達(dá)，具體操作同1.4。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。分別應(yīng)用配對t檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較膀胱癌和癌旁正常組織、SV-HUC-1細(xì)胞和5637細(xì)胞中miR-130a-3p和SPOCK1表達(dá)的差異；應(yīng)用單因素方差分析比較空白對照組、miR-130a-3p組和miR-con組以及空白對照組、si-SPOCK1組和si-con組細(xì)胞中miR-130a-3p、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)、凋亡率、MMP-2、Caspase-3、SPOCK1蛋白表達(dá)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；miR-con組和miR-130a-3p組細(xì)胞熒光素酶活性的比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；4組細(xì)胞中SPOCK1蛋白表達(dá)的比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同組織及細(xì)胞中miR-130a-3p和SPOCK1蛋白的表達(dá)結(jié)果見表1、2。與癌旁正常組織相比，膀胱癌組織中miR-130a-3p的表達(dá)量降低，SPOCK1 mRNA和蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。與正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1相比，膀胱癌細(xì)胞5637中miR-130a-3p的表達(dá)量降低，SPOCK1 mRNA和蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，與組織中檢測結(jié)果一致。

表1 膀胱癌及癌旁正常組織中miR-130a-3p和SPOCK1表達(dá)的比較(n=3)

表2 SV-HUC-1和5637細(xì)胞中miR-130a-3p和SPOCK1表達(dá)的比較(n=3)

2.2轉(zhuǎn)染miR-130a-3p和沉默SPOCK1對5637細(xì)胞存活、侵襲、遷移、凋亡及MMP-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖1，表3、4。5637細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后miR-130a-3p的相對表達(dá)量升高，說明miR-130a-3p轉(zhuǎn)染成功。與miR-con組比較，miR-130a-3p組細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高，同時MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。

表3 轉(zhuǎn)染miR-130a-3p對膀胱癌5637細(xì)胞存活、侵襲、凋亡及miR-130a-3p、MMP-2、Caspase-3表達(dá)的影響(n=3)

轉(zhuǎn)染si-SPOCK1后，5637細(xì)胞中SPOCK1表達(dá)水平低于si-con組(P<0.05)，表明構(gòu)建沉默SPOCK1模型成功。與si-con組相比，si-SPOCK1組細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高，同時MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。

1、4：空白對照組;2:miR-con組;3:miR-130a-3p組;5：si-con組；6：si-SPOCK1組

表4 沉默SPOCK1對膀胱癌5637細(xì)胞存活、侵襲、凋亡及SPOCK1、MMP-2、Caspase-3表達(dá)的影響(n=3)

2.3miR-130a-3p與SPOCK1靶向關(guān)系的驗(yàn)證利用TargetScan對miR-130a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(圖2A)，發(fā)現(xiàn)SPOCK1 3’UTR存在部分堿基可與miR-130a-3p互補(bǔ)配對。表5中雙熒光素酶基因報告檢測結(jié)果顯示，miR-130a-3p與野生型(WT)SPOCK1 3’UTR有相互作用。Western blot結(jié)果表明，miR-130a-3p組比miR-con組SPOCK1蛋白表達(dá)量降低，而anti-miR-130a-3p組較anti-miR-con組SPOCK1蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)(圖2B和表6)。

上：miR-130a-3p和SPOCK1的3’UTR結(jié)合位點(diǎn)；下：5637細(xì)胞中SPOCK1蛋白的表達(dá)；1：miR-con組；2：miR-130a-3p組；3：anti-miR-con組；4：anti-miR-130a-3p組

表5 5637細(xì)胞雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果(n=3)

表6 4組5637細(xì)胞中SPOCK1蛋白表達(dá)的比較(n=3)

3 討論

膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，在男性和吸煙者中發(fā)病率較高[11]，在全世界癌癥中排名第9，2012年造成165 000人死亡，新增病例大概有430 000例[12]。目前，雖然手術(shù)切除、放療、化療等治療方法逐漸發(fā)展起來，但一系列的不良反應(yīng)、毒性和抗藥性等導(dǎo)致膀胱癌的治療效果仍不理想。因此，深入了解膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有效的監(jiān)測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，對于膀胱癌的臨床治療具有重要意義。

miR是一類約有22個核苷酸長度的非編碼RNA，通過與互補(bǔ)信使RNA的特定位點(diǎn)結(jié)合來執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，降解或抑制miR在許多病理過程中發(fā)揮著重要作用[13]。研究[14]表明，miR-130a-3p與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌干細(xì)胞中，miR-130a-3p表達(dá)下調(diào)，miR-130a-3p過表達(dá)可抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15]。在胃癌組織中，miR-130a-3p顯著下調(diào)，miR-130a-3p過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲[16]。在鼻咽癌細(xì)胞中，miR-130a-3p通過抑制趨化因子CXCL12抑制NPC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而阻止鼻咽癌進(jìn)程[17]。本研究中，miR-130a-3p在膀胱癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics可抑制膀胱癌細(xì)胞存活、遷移侵襲能力和MMP-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和Caspase-3蛋白表達(dá)，說明miR-130a-3p對膀胱癌具有抑癌作用。

SPOCK1是一種蛋白多糖，屬于新發(fā)現(xiàn)的Ca2+結(jié)合蛋白多糖家族，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。研究[18-20]表明，SPOCK1在多種腫瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成、遷移侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。Li等[21]的研究表明，SPOCK1是miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p共同的靶基因，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，miR-139-5p、miR-940和miR-193a-5p通過下調(diào)SPOCK1抑制肝癌惡化。miR-150-5p和miR-150-3p直接靶向SPOCK1抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲性[22]。本研究中，SPOCK1 mRNA和蛋白在膀胱癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默SPOCK1表達(dá)可引起膀胱癌5637細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡率升高，說明SPOCK1可促進(jìn)膀胱癌進(jìn)程，這與吳常文等[8]的報道一致。此外，沉默SPOCK1表達(dá)還會影響MMP-2和Caspase-3蛋白表達(dá)。

分析miR-130a-3p和SPOCK1的靶向關(guān)系發(fā)現(xiàn)，SPOCK1可能是miR-130a-3p的靶基因。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌5637細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)miR-130a-3p表達(dá)可調(diào)控SPOCK1蛋白水平，miR-130a-3p對SPOCK1的表達(dá)具有負(fù)性調(diào)控作用，SPOCK1是miR-130a-3p的功能性靶基因。

綜上所述，miR-130a-3p可能通過靶向調(diào)控SPOCK1的表達(dá)來抑制膀胱癌細(xì)胞存活、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為膀胱癌的臨床治療提供了新思路。