尚 華,熊金河,何 芳,江 丹

遂寧市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 四川遂寧629000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)組織慢性炎癥，病變關(guān)節(jié)伴有滑膜增生、血管翳形成以及關(guān)節(jié)軟骨損傷[1]。RA患者周身多關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，若治療不及時將導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，甚至?xí)奂靶难芎头蔚冉M織器官[2]。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是目前所知的機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞，成熟的DCs可以高表達多種共刺激分子(如CD40、CD80、CD86等)，高水平分泌多種炎癥細胞因子(如IL-12、腫瘤壞死因子α等)[3]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是一種可以識別病原體并激活免疫細胞直接產(chǎn)生防御的天然免疫受體。TLR4是第一個被發(fā)現(xiàn)的TLR，它通過識別不同配體促進多種炎癥細胞因子及趨化因子的合成與釋放，最終誘發(fā)和增強炎癥反應(yīng)[4]。研究[5-6]表明，RA患者外周血CD14+單核細胞中TLR4表達上調(diào)，且其表達與血清IL-18水平呈正相關(guān)；RA患者外周血CD8+T細胞上TLR4表達上調(diào)，TLR4參與CD8+T細胞的活化和炎癥表型的表達，從而在RA發(fā)病和進展過程中發(fā)揮重要作用。Hatterer等[7]的研究也證實TLR4可以誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞因子的釋放。

來氟米特(leflunomide，LEF)是一種異噁唑類免疫抑制劑，能抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性，通過抑制嘧啶的全程生物合成，從而抑制淋巴細胞的增殖，通常用于RA等多種自身免疫性疾病的治療[8]。近年來已有研究[9-11]表明LEF能夠抑制DCs的成熟過程，減少其炎癥因子的分泌，降低機體免疫活性，發(fā)揮治療RA的作用。本研究觀察了不同濃度LEF對RA患者DCs TLR4表達及免疫功能的影響，探討LEF治療RA的作用機制，為RA的治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco-BRL公司；LEF購自北京百奧萊博科技有限公司；胰蛋白酶、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；Trizol試劑、PVDF膜、ECL發(fā)光液、絲裂霉素C、RIPA裂解液購自北京Solarbio公司；MTT、DMSO購于美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4均購自Peprotech公司；FITC、PE標記的CD80、CD86流式抗體購于eBioscience公司；兔抗人TLR4多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG、人IL-12和IL-6 ELISA檢測試劑盒購自Abcam公司。

1.2DCs的來源

1.2.1 研究對象 選取2017年5月至2018年3月就診于遂寧市中心醫(yī)院的50例RA患者，其中男27例，女23例?；颊呷脒x標準：年齡30～70歲，性別不限；已簽署知情同意書，自愿參與本課題研究；符合2009年歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(EULAR)和美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)聯(lián)合推出的RA診斷標準。有下列任意一項者均不入選：嚴重心腦血管、肝腎疾??；惡性腫瘤、敗血癥、嚴重感染；其他自身免疫性疾??；對LEF或其中成分過敏。選取該院50名健康醫(yī)護人員為健康志愿者，其中男26例，女24例，年齡30 ～70歲，均無哮喘、糖尿病，無肝功能異常、血液系統(tǒng)功能障礙疾病，無冠心病病史、手術(shù)史、輸血史，近1個月內(nèi)無感染史，近3個月內(nèi)未使用相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑。以上研究對象入選和排除標準均參考文獻[12]。

1.2.2 DCs的分離與培養(yǎng) 抽取研究對象靜脈血100 mL，加入肝素抗凝，加等量Hanks液混勻稀釋后，緩慢加入含淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min，輕取界面白色霧狀細胞層，Hanks液清洗，獲得單個核細胞。將GM-CSF和IL-4加入含有體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，終濃度均為10 μg/L，制成聯(lián)合培養(yǎng)基。將單個核細胞接種至6孔平底培養(yǎng)板，使用聯(lián)合培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，吸棄上清，用RPMI 1640培養(yǎng)基輕洗3次，獲得貼壁細胞，加聯(lián)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天吸去75%培養(yǎng)液，添加聯(lián)合培養(yǎng)基，再培養(yǎng)7 d。

1.3實驗分組參考文獻[13]。收集RA患者的DCs混合，分別用0(RA組)、15、30、60 mg/L的LEF處理12 h。將健康志愿者的DCs混合后，作為正常對照。

1.4DCs中TLR4mRNA的檢測將DCs用Trizol法提取總RNA，檢測RNA濃度和純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參，進行PCR。TLR4正向引物序列為5’-TGGATACGTTTCCT TATAAG-3’,反向為5’-GAAATGGAGGCACCCCT TC-3’;GAPDH正向引物序列為5’-TGCACCAC CAACTGCTTAGC-3’,反向為5’-GGCATGGACTGT GGTCATGAG-3’。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，補蒸餾水至20 μL。所有操作在冰上進行。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。重復(fù)測定3次。

1.5DCs中TLR4蛋白的檢測將DCs用RIPA裂解液裂解后，4 ℃12 000×g離心20 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗人TLR4(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌；ECL發(fā)光顯影。用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One軟件測定條帶灰度值，目的條帶和GAPDH條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。重復(fù)測定3次。

1.6DCs細胞表型的檢測收集DCs，胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，與FITC或PE標記的CD80、CD86流式抗體混合，4 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μL的PBS溶液重懸，上流式細胞儀檢測，記錄陽性細胞百分比。重復(fù)測定3次。

1.7DCs細胞中IL-6、IL-12含量的檢測收集DCs，胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，超聲粉碎后離心取上清，分別使用IL-6、IL-12 ELISA檢測試劑盒檢測IL-6、IL-12含量。重復(fù)測定3次。

1.8DCs對淋巴細胞增殖活性的影響采用混合淋巴細胞實驗[14]方法。收集RA患者的DCs，制備成1×106個/mL的細胞懸液，加入絲裂霉素C使終濃度為25 mg/L，37 ℃水浴孵育30 min，離心取沉淀，用PBS洗滌，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×109個/mL，作為刺激細胞。取健康志愿者外周血10 mL，經(jīng)過淋巴細胞分離液梯度離心后獲取單個核細胞，置于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，吸取懸浮細胞，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×109個/mL，作為反應(yīng)細胞。分別取兩種細胞各100 μL至培養(yǎng)板混合，然后置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。加入20 μL的MTT(5 g/L)溶液孵育4 h，去除多余培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO振蕩反應(yīng)10 min，使用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度(A)值，表示反應(yīng)細胞的增殖活性。重復(fù)測定3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。5組DCs中TLR4 mRNA和蛋白的相對表達量、細胞表型、IL-6和IL-12含量、反應(yīng)細胞增殖活性的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.15組DCs中TLR4表達的比較見圖1、表1。與正常對照組相比，RA組DCs中TLR4 mRNA和蛋白相對表達量均升高(P<0.05)；與RA組比較，RA+LEF 15、30和60 mg/L組細胞中TLR4 mRNA和蛋白相對表達量均降低(P<0.05)，且LEF作用濃度越大，TLR4表達降低越顯著(P<0.05)。

1:正常對照組；2：RA組；3、4、5：RA+LEF 15、30和60 mg/L組

表1 5組DCs中TLR4表達的比較

2.25組DCs細胞表型的比較見表2。與正常對照組相比，RA組CD80+、CD86+細胞百分比均升高(P<0.05)；與RA組相比，RA+LEF 15、30和60 mg/L組CD80+、CD86+細胞百分比均降低(P<0.05)，且LEF作用濃度越大，CD80+、CD86+細胞百分比下降越顯著(P<0.05)。

2.35組DCs中 IL-12和IL-6含量的比較見表2。與正常對照組相比，RA組DCs中IL-12和IL-6含量均升高(P<0.05)；與RA組相比，RA+LEF 15、30和60 mg/L組DCs中IL-12和IL-6含量均降低(P<0.05)，且LEF作用濃度越大，DCs中IL-12、IL-6含量下降越顯著(P<0.05)。

2.45組DCs對淋巴細胞體外增殖活性的影響見表2。與正常對照組相比，RA組反應(yīng)細胞的增殖活性升高(P<0.05)；與RA組相比，RA+LEF 15、30和60 mg/L組反應(yīng)細胞的增殖活性均降低(P<0.05)，且LEF作用濃度越大，反應(yīng)細胞增殖活性降低越顯著(P<0.05)。

表2 5組DCs細胞表型、IL-12和IL-6含量及反應(yīng)細胞增殖活性的比較

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[15]，治療的關(guān)鍵在于控制關(guān)節(jié)及其他組織的炎癥，保持關(guān)節(jié)功能、防止畸形，修復(fù)受損關(guān)節(jié)以減輕疼痛和恢復(fù)功能[16]。LEF是第一個專門針對RA的改善病程藥物，具有獨特的作用機制，可以有效地控制疾病的進展，阻止骨質(zhì)破壞，改善患者的生活質(zhì)量[17]。研究[18]表明LEF可降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中CD83的表達，抑制共刺激分子CD86和HLA-DR的表達，抑制DCs的成熟。LEF能顯著減少RA患者外周血中Th1/Tc1型細胞因子[19]。LEF可通過抑制Th1型細胞和單核/巨噬細胞CCR5的表達，減輕RA患者Th1型細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[20]。

未成熟的DCs攝取抗原后，遷移到淋巴結(jié)，逐漸發(fā)育成為成熟DCs，成熟DCs能誘導(dǎo)幼稚T細胞分化成熟，從而啟動免疫應(yīng)答，在RA發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)，非甾體抗雌激素可以抑制滑膜巨噬細胞分化為DCs，抑制其對T細胞的刺激作用[24]；環(huán)孢素能顯著抑制前體DCs的成熟，抑制其表面共刺激分子的表達，抑制同種T細胞的增殖能力[25]。LEF作為一種免疫抑制劑，已有研究發(fā)現(xiàn)其可以阻礙DCs的成熟過程。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)LEF能夠抑制DCs產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，通過下調(diào)CD80和CD86的表達抑制DCs成熟。Kirsch等[27]發(fā)現(xiàn)在分化或成熟階段用LEF活性代謝物(A771726、LEF-M)處理DCs會導(dǎo)致其成熟失敗，CD40和CD80的表達降低；LEF-M顯著影響DCs啟動T細胞增殖、生成促炎細胞因子IL-12和TNF-α的能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照DCs比較，RA患者DCs中TLR4高表達，CD80、CD86高表達，IL-12和IL-6含量亦升高。經(jīng)過不同濃度LEF處理后，RA患者DCs中TLR4的表達、CD80和CD86的表達及IL-12和IL-6含量均顯著降低；用LEF處理過的RA患者的DCs進行混合淋巴細胞實驗，反應(yīng)細胞的增殖能力均明顯受到抑制；且LEF作用濃度越大，上述指標的變化越顯著。

綜上所述，LEF可以抑制RA患者DCs的免疫功能，其機制可能與調(diào)控TLR4的表達有關(guān)。