夏 冰，劉福云， 張 宇， 陸亞東， 邢光衛(wèi)， 郭永成， 牛學(xué)強(qiáng)， 董延召， 李新偉

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒骨科 鄭州 450052

馬蹄內(nèi)翻足是小兒骨科常見的足踝畸形，分為特發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型,其中約80%患兒病因不明確且不合并其他系統(tǒng)畸形，稱為特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足。特發(fā)性和繼發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足由于病因不同，導(dǎo)致其病變肌肉的病理改變也可能不同。繼發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足多見于脊髓栓系綜合征，由于中樞及外周神經(jīng)損傷，導(dǎo)致踝關(guān)節(jié)周圍肌肉神經(jīng)支配異常，進(jìn)而出現(xiàn)肌力不平衡，最終發(fā)展為馬蹄內(nèi)翻足。與特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足相比，繼發(fā)于失神經(jīng)支配的馬蹄內(nèi)翻足矯形更為困難,臨床復(fù)發(fā)率和并發(fā)癥發(fā)生率均較高[1]。本研究通過光鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察特發(fā)性和繼發(fā)于脊髓栓系綜合征的馬蹄內(nèi)翻足患兒腓腸肌組織結(jié)構(gòu)的變化及差異，報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2011年1月1日至2017年12月31日在我院診治的繼發(fā)于脊髓栓系綜合征的馬蹄內(nèi)翻足患兒23例(共29足)作為試驗組。其中男15例，女8例，年齡7個月～3歲4個月；單側(cè)17例，雙側(cè)6例。對照組取同期接受跟腱延長手術(shù)治療的特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足患兒12例(共17足)，其中男9例，女3例，年齡9個月～2歲9個月；單側(cè)7例，雙側(cè)5例。試驗組中脊髓病變位于胸段(T2～T10)1例，胸腰段(T11～L1)2例，腰段(L2～L3)5例，腰骶段(L4～S1)14例，骶尾部(S2以下)1例；合并脊柱側(cè)彎5例，髖關(guān)節(jié)脫位2例；足部感覺喪失3例，感覺減退14例，感覺正常6例。對照組均無脊髓病變及感覺異常。本研究經(jīng)患兒家屬知情同意并得到醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2病理組織學(xué)觀察術(shù)中取腓腸肌遠(yuǎn)端、腱腹交界近端2 cm肌腹深處活體組織，所有標(biāo)本去除擠壓、牽拉的組織后，均沿肌纖維方向取大小約1 mm×1 mm×2 mm的長條。

1.2.1 光鏡觀察 取出患兒部分腓腸肌, 甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、6 μm厚切片；HE染色，乙醇脫水后用二甲苯透明切片，樹膠封固并蓋上蓋玻片，使用OLYMPUS BX53光鏡觀察。

1.2.2 掃描電鏡觀察 取患兒腓腸肌，生理鹽水清洗標(biāo)本表面。戊二醛固定液固定，PBS浸洗2次，4 ℃四氧化鋨固定液固定2 h，PBS浸洗2次，丙酮梯度脫水，乙醇醋酸雙氧鈾塊染色2 h或過夜。醋酸戊酯置換10 min。臨界點(diǎn)干燥后噴金，S-3500掃描電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 透射電鏡觀察 取患兒腓腸肌，生理鹽水清洗。戊二醛固定，PBS浸洗3次，四氧化鋨固定液4 ℃固定2 h，PBS浸洗2次，丙酮梯度脫水，乙醇醋酸雙氧鈾塊染色2 h或過夜。還氧丙烷置換10 min。37 ℃條件下用丙酮與環(huán)氧樹脂按體積比3∶1、1∶11、1∶13依次混合浸透15 min，然后純樹脂浸透30 min；盛于有環(huán)氧樹脂812、815包埋液的包埋板中。置入烤箱，37 ℃、45 ℃、60 ℃各24 h進(jìn)行聚合反應(yīng)；Leica超薄切片機(jī)厚約50 nm切片。醋酸雙氧鈾電子染色45 min，檸檬酸鉛電子染色30 min，使用H-7500型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0分析。試驗組和對照組肌纖維脂肪變性和肌絲強(qiáng)直性收縮發(fā)生率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1腓腸肌光鏡觀察結(jié)果試驗組及對照組光鏡下均可見腓腸肌肌纖維呈長柱形，細(xì)胞核呈橢圓形，位于肌膜的下方；肌漿內(nèi)肌原纖維豐富，呈細(xì)絲狀，可見I帶和A帶(圖1)。試驗組腓腸肌肌絲空泡化嚴(yán)重，纖維化和脂肪化明顯，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；細(xì)胞核呈條索狀；出現(xiàn)大量的成纖維細(xì)胞。對照組僅部分腓腸肌呈現(xiàn)上述變化。

試驗組75.9%(22/29)出現(xiàn)肌纖維脂肪變性，對照組為35.3%(6/17)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.405，P=0.007)。

A:對照組;B:試驗組

2.2腓腸肌掃描電鏡下表現(xiàn)對照組膠原纖維增粗，大部分標(biāo)本肌束排列及走形良好，僅部分存在缺損及扭曲，少數(shù)標(biāo)本出現(xiàn)肌肉萎縮(圖2A)；試驗組部分膠原纖維增粗明顯，肌束水腫、間隙增大，肌節(jié)排列紊亂、增寬，部分有缺損(圖2B)。

試驗組44.8%(13/29)出現(xiàn)肌絲強(qiáng)直性收縮，對照組為11.8%(2/17)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.331，P=0.021)。

A:對照組;B:試驗組

2.3腓腸肌透射電鏡下表現(xiàn)對照組鏡下可見線粒體腫大，部分空泡化，部分嵴與膜融合，嵴有溶解、斷裂、缺失；肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張；肌絲排列輕中度紊亂，Z線增寬、H帶縮短；糖原數(shù)量輕度減少；膠原纖維橫紋規(guī)律性存在，纖維較粗，排列整齊(圖3A)。試驗組大量線粒體出現(xiàn)空泡化、萎縮和破裂，嵴與膜融合、模糊不清，多數(shù)嵴發(fā)生溶解、斷裂、缺失；肌絲腫脹、Z線及H帶紊亂不清、對位不良、殘缺和溶解；肌纖維細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞膜消失；肌原纖維間隙較大，數(shù)量減少，肌絲強(qiáng)直性收縮明顯；肌纖維束間糖原數(shù)量明顯減少(圖3B)。

A:對照組;B:試驗組

3 討論

馬蹄內(nèi)翻足是小兒骨科常見畸形，根據(jù)其臨床癥狀出現(xiàn)早晚及有無合并畸形，分為特發(fā)性及繼發(fā)性兩種類型。繼發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足可見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及外周神經(jīng)損傷，特別是多見于脊髓栓系綜合征，常常合并髖、膝、足踝部畸形,大小便功能障礙,下肢肌肉麻痹，肌力失衡及下肢感覺功能障礙[2]。據(jù)文獻(xiàn)[3-4]報道，30%～50%的脊髓栓系綜合征患者可能繼發(fā)馬蹄內(nèi)翻足，且畸形程度往往較重，治療后復(fù)發(fā)率及并發(fā)癥發(fā)生率較特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足高[1],預(yù)后較差。國內(nèi)外曾有學(xué)者[5-6]對特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足內(nèi)側(cè)及小腿前外側(cè)深筋膜進(jìn)行電鏡觀察及分析，可見成纖維細(xì)胞相對增多、細(xì)胞體積增大、胞質(zhì)豐富、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫大等，但均未對患足周圍肌肉組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。

本研究結(jié)果顯示，光鏡下試驗組75.9%出現(xiàn)肌纖維脂肪變性，對照組為35.3%，提示與特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足相比，繼發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足腓腸肌在失神經(jīng)支配下，肌纖維更容易出現(xiàn)脂肪變性；掃描電鏡下，試驗組44.8%出現(xiàn)肌絲強(qiáng)直性收縮，而對照組僅為11.8%，且為輕微強(qiáng)直性收縮，提示失神經(jīng)支配下，腓腸肌收縮功能更差，更容易出現(xiàn)強(qiáng)直性收縮。國外學(xué)者[7]在大鼠實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)：大鼠脊髓損傷時，骨骼肌會迅速失去質(zhì)量和收縮力，繼而導(dǎo)致肌原纖維和收縮蛋白的快速分解以及糖原儲備減少，造成骨骼肌進(jìn)行性萎縮及功能減退，甚至出現(xiàn)強(qiáng)直性收縮[8]，肌肉組織最終出現(xiàn)纖維化和脂肪變性。這與我們在試驗組觀察到的肌纖維脂肪變性增加、肌絲強(qiáng)直性收縮增多等結(jié)果一致。

本研究透射電鏡下還發(fā)現(xiàn)大量線粒體空泡化、萎縮、破裂，嵴溶解、斷裂、缺失，肌纖維束間糖原數(shù)量明顯減少，提示繼發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足腓腸肌在失神經(jīng)支配后其病理改變更重。這可能是其治療困難、復(fù)發(fā)率相對較高且預(yù)后更差的重要原因。

有學(xué)者[9]在小鼠實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，骨骼肌失神經(jīng)支配后，線粒體呼吸功能和細(xì)胞色素c氧化酶活性降低，小鼠腓腸肌線粒體DNA拷貝數(shù)量減少；此外受損的線粒體將產(chǎn)生高水平的活性氧，并釋放促凋亡因子，如細(xì)胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子等，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[10]。這些病理改變不僅使肌細(xì)胞供能減少，還可導(dǎo)致肌細(xì)胞萎縮、生長減慢及停滯，進(jìn)一步降低腓腸肌收縮功能[11]。

綜上所述，與特發(fā)性馬蹄內(nèi)翻足腓腸肌相比，繼發(fā)于脊髓栓系綜合征的馬蹄內(nèi)翻足腓腸肌脂肪變性、肌絲強(qiáng)直收縮、腓腸肌內(nèi)線粒體空泡化等超微結(jié)構(gòu)改變更為明顯，提示失神經(jīng)支配狀態(tài)下導(dǎo)致的繼發(fā)畸形病變更為嚴(yán)重，治療上也更加困難。但對于跟腱延長治療后的腓腸肌超微結(jié)構(gòu)如何變化還有待進(jìn)一步研究。