賈瑞諾，李婉瑩，李若楠，孔德九，孔金玉，高社干

1)河南科技大學第一附屬醫(yī)院 河南洛陽 471003 2)河南科技大學臨床醫(yī)學院 河南洛陽 471003 3)河南省腫瘤表現遺傳重點實驗室 河南洛陽 471003

賁門腺癌(gastric cardia adenocarcinoma，GCA)是上消化道最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生在食管、胃交界線下約2 cm范圍內，又稱為食管-胃交界腺癌[1]。我國林州市及其毗鄰區(qū)域是世界上食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和GCA發(fā)病率以及病死率最高的地區(qū)[2-3]。近年來GCA發(fā)病率明顯上升[4-5]。研究[6-7]顯示C20orf54是ESCC與GCA的重要遺傳易感基因。C20orf54又稱核黃素轉運基因2，負責編碼核黃素轉運蛋白2，在核黃素的跨膜轉運過程中起關鍵作用。核黃素缺乏已經被證實是我國ESCC與GCA高發(fā)的危險因素[6-9]。目前，C20orf54在GCA發(fā)生、進展過程中的作用尚不明確。本研究檢測了C20orf54在GCA組織中的表達情況，并探討其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2009年2月至2010年10月在河南科技大學第一附屬醫(yī)院確診為原發(fā)性GCA的患者60例，其中男38例，女22例，年齡40～70(52.0±3.5)歲。所有患者均采用根治性手術治療。選取手術切除癌組織及其癌旁正常賁門黏膜組織(距離癌組織5 cm以上)，若腫瘤邊界越過賁門范圍，則取正常胃黏膜，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2C20orf54mRNA的RT-PCR法檢測應用Trizol試劑盒(加拿大Invitrogen公司產品)從GCA和癌旁正常黏膜組織中分別提取總RNA。按照說明書要求，利用PrimeScript試劑盒(TaKaRa公司產品)獲得cDNA。利用SYBR Premix ExTaq Ⅱ(TaKaRa公司產品)和ABI PRISM 7300 系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司產品)檢測C20orf54 mRNA的表達水平，以GAPDH為內參。C20orf54引物序列：上游5’-GGATACTGCTTAAGCTAGGCCTCGA-3’，下游5’-CCGGTATCGTACGTCACTAGTCGGTGG-3’。反應體系：MgCl2(25 mmol/L)4 μL，反轉錄10×緩沖液2 μL，dNTP混合物(10 mol/L)2 μL，重組RNasina核糖核酸酶抑制劑0.5 μL，AMV反轉錄酶15 μL，Oligo(dT)15引物0.5 μg，卡那霉素陽性對照RNA/總RNA 1 μg，加無核酸酶無離子水至總體積20 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，61 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，33個循環(huán)；72 ℃末次延伸5 min。利用凝膠成像分析系統(tǒng)GDS-8000掃描成像及拍照，以目的基因與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.3C20orf54蛋白的Western blot法檢測用RIPA裂解液裂解待測組織，提取總蛋白，120 g/L SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉移至硝酸纖維素膜(美國MiLople公司產品)，30 g/L脫脂牛奶封閉，室溫下孵育1.5 h，加C20orf54一抗(美國R&D公司產品，1∶200稀釋)、Tubulin抗體(武漢艾美捷生物技術有限公司產品，1∶1 000稀釋)孵育3 h。室溫下用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(武漢艾美捷生物技術有限公司產品，1∶18 000稀釋)孵育1.5 h。采用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)觀察蛋白條帶，以Tubulin為內參。使用Image Pro Plus 6.0軟件對結果進行分析。以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.4C20orf54蛋白的免疫組化SP法檢測GCA和癌旁正常黏膜組織常規(guī)切片、脫蠟、脫水、封閉血清，加一抗、二抗(同1.3)，DAB顯色、蘇木精復染、透明、封片，顯微鏡下觀察。兔抗綿羊二步法免疫組化SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。隨機觀察5個視野(×200)，以胞質出現棕黃色染色為陽性細胞。按陽性細胞百分率評分：0%～為0分，5%～為1分，25%～為2分，≥75%為3分。按細胞質著色程度評分：未著色為0分，淺黃色著色為1分，棕黃色著色為2分，棕褐色著色為3分。兩項得分相乘，<2分判為低表達，≥2分為高表達。

1.5隨訪從確診為GCA的第1天開始采用門診及電話的方式對患者進行隨訪，每3個月1次。隨訪截止時間為2013年12月31日。隨訪期間27例由于GCA相關的并發(fā)癥或復發(fā)、遠處轉移死亡；失訪1例?？偵嫫?OS)定義為從腫瘤確診起至末次隨訪或者任何原因引起死亡的時間。

1.6統(tǒng)計學處理用SPSS 19.0進行分析。GCA組織和癌旁正常黏膜組織中C20orf54 mRNA、蛋白表達的比較采用配對t檢驗，蛋白高表達率比較采用配對χ2檢驗。不同臨床病理特征GCA患者C20orf54蛋白表達的比較采用χ2檢驗。對C20orf54蛋白高表達和低表達GCA患者進行Kaplan-Meier生存分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1GCA和癌旁正常黏膜組織中C20orf54表達的比較見圖1和表1。

T：GCA組織；N：癌旁正常黏膜組織

表1 GCA和癌旁正常黏膜組織中C20orf54的表達

2.2GCA和癌旁正常黏膜組織中C20orf54蛋白表達的免疫組化結果見圖2和表2。

圖2 GCA(A)和癌旁正常黏膜(B)組織中C20orf54蛋白的表達(SP，×200)

表2 GCA和癌旁正常黏膜組織中C20orf54蛋白表達的比較例

2.3不同臨床病理特征GCA患者C20orf54蛋白表達的比較見表3。

表3 不同臨床病理特征GCA患者C20orf54蛋白表達的比較

2.4C20orf54蛋白表達與GCA患者預后的關系C20orf54蛋白高表達和低表達GCA患者的Kaplan-Meier生存曲線見圖3。C20orf54蛋白高表達組與低表達組的生存曲線差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.953，P<0.001)，中位生存期(T75,T25)分別是40.2(34.2,50.4)和23.1(14.4,29.8)個月。

圖3 C20orf54蛋白高表達與低表達GCA患者的生存曲線

3 討論

C20orf54基因定位于20p13，其mRNA全長2 716 bp(NM_033409.3)，共有5個外顯子，編碼一個由469個氨基酸組成的開放閱讀框蛋白[10]。C20orf54被認為在人體吸收核黃素過程中起重要作用。C20orf54基因中多個位點突變會導致一種罕見的神經退行性疾病Brown-Vialetto-Van Laere syndrome(BVVLS)發(fā)生，細胞膜轉運定位核黃素的能力減退或缺失，進而體內核黃素水平下降[11-13]。全基因組關聯分析通過大樣本檢測SNP，發(fā)現C20orf54的一個SNP位點rs13042395是ESCC和GCA的易感基因位點[6-7]。研究[10]顯示C20orf54基因可抑制ESCC細胞生長并促進其凋亡，在ESCC的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色。沈瓊等[8]較早的研究表明，采用復合核黃素阻斷治療食管上皮重度增生，ESCC發(fā)病明顯低于自然癌變率，長期使用復合核黃素可以降低ESCC的發(fā)病率和死亡率。

本研究結果顯示GCA組織中C20orf54 mRNA及蛋白的表達較癌旁正常黏膜組織降低；在浸潤深度T3、T4，中、低分化，有淋巴結轉移和臨床分期Ⅲ、Ⅳa期的GCA組織中，C20orf54蛋白高表達率明顯下調；生存分析結果顯示C20orf54高表達的GCA 患者預后優(yōu)于低表達者。以上結果與既往研究結果[10,14]一致 。

綜上所述，C20orf54可能是GCA發(fā)生發(fā)展進程中的保護因素，其表達下調或缺失可能促進GCA的發(fā)生、侵襲和轉移，預示不良預后。