王 平，王中顯，王冬花，龔世雄，向 麗，賀 漪

武漢市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科 武漢 430022

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命[1]。因此探究卵巢癌發(fā)病機制及尋找有效的治療方式具有重要意義。近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞凋亡途徑之一。CTNNB1是一種原癌基因，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和周期調(diào)控等多種生物學(xué)特性，與腫瘤的發(fā)生和進展密切相關(guān)[2]。CTNNB1基因在肝癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤組織中呈高表達，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等有關(guān)[3-4]。然而CTNNB1對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機制目前尚不十分清楚。因此，作者觀察了下調(diào)人卵巢癌HO8910細(xì)胞中CTNNB1的表達對細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響并探究其可能的作用機制，為卵巢癌的分子靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人卵巢癌HO8910細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自美國HyClone公司；二甲基亞砜購自美國Sigma公司；CTNNB1 siRNA、非特異性siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；RNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；ECL顯影試劑購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司； PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；鼠抗人CTNNB1、β-actin一抗及山羊抗鼠二抗購自美國Abcam公司；Caspase-3活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2細(xì)胞分組及處理人卵巢癌HO8910細(xì)胞接種于含100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置含體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的HO8910細(xì)胞進行后續(xù)實驗。HO8910細(xì)胞分為3組：正常對照組、陰性對照組和CTNNB1 siRNA組。正常對照組細(xì)胞不做任何處理；陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染非特異性siRNA；CTNNB1 siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染CTNNB1 siRNA。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染6 h后更換為含抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組均3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3HO8910細(xì)胞中CTNNB1、XBP1和ATF4mRNA表達的qRT-PCR法檢測收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組HO8910細(xì)胞， PBS洗滌3次，按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，以超微量紫外分光光度計進行定量分析，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green PCR檢測試劑盒行qRT-PCR。CTNNB1上游引物序列為5’-TCCCACTCCTACGGAGAGAA-3’，下游引物序列為5’-GAAGGTCGGAAGGAAGG-3’，產(chǎn)物大小128 bp；XBP1上游引物序列為5’-AAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGC-3’，下游引物序列為5’-TCCTTCTGG GTAGACCTCTGGGAG-3’， 產(chǎn)物大小227 bp； ATF4上游引物序列為5’-GTTGGTCAGTGCCTCAGACA-3’，下游引物序列為5’-CATTCGAAACAGAGCATC GA-3’, 產(chǎn)物大小133 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5’-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3’，下游引物序列為5’-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3’, 產(chǎn)物大小299 bp；引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算CTNNB1、XBP1和ATF4 mRNA相對表達量。

1.4HO8910細(xì)胞中CTNNB1蛋白表達的Western blot法檢測轉(zhuǎn)染48 h后收集各組HO8910細(xì)胞，分別加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，提取總蛋白，以BCA法對提取的蛋白質(zhì)進行定量測定。將蛋白質(zhì)和上樣緩沖液混勻，加熱致蛋白變性。取蛋白樣品加入到蛋白上樣孔行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜置于脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，加入CTNNB1一抗(1∶500稀釋)4 ℃雜交過夜，TBST洗膜3次后加入二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜后以ECL化學(xué)發(fā)光，顯影、定影后用凝膠成像儀拍照，采用Image J圖像分析系統(tǒng)檢測目的蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以CTNNB1蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值表示CTNNB1蛋白相對表達量。

1.5HO8910細(xì)胞凋亡率的Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染48 h后取各組HO8910細(xì)胞，經(jīng)消化后用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以Binding Buffer重懸細(xì)胞，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，添加Annexin Ⅴ-FITC溶液5 μL，混勻后再加入PI溶液5 μL，充分混勻后避光反應(yīng)20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6HO8910細(xì)胞中Caspase-3活性的分光光度計法檢測收集轉(zhuǎn)染48 h后各組HO8910細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液置冰上裂解10 min，離心收集上清，以Caspase-3活性檢測試劑盒測定Caspase-3活性。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。不同組間CTNNB1、XBP1和ATF4 mRNA相對表達量，CTNNB1蛋白相對表達量、細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.13組HO8910細(xì)胞中CTNNB1mRNA和蛋白相對表達量的比較結(jié)果見圖1、表1。與正常對照組和陰性對照組比較，CTNNB1 siRNA組CTNNB1 mRNA和蛋白相對表達量均下降。

1：正常對照組；2：陰性對照組；3：CTNNB1 siRNA組

表1 3組HO8910細(xì)胞中CTNNB1 mRNA和蛋白相對表達量的比較

2.23組HO8910細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、XBP1和ATF4mRNA相對表達量的比較結(jié)果見表2。與正常對照組和陰性對照組比較，CTNNB1 siRNA組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、XBP1和ATF4 mRNA相對表達量均升高。

表2 3組HO8910細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、XBP1和ATF4 mRNA相對表達量的比較

3 討論

卵巢癌細(xì)胞自身過度增殖、易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特性，導(dǎo)致傳統(tǒng)治療方式難以取得良好的效果。因此尋找高效治療卵巢癌的措施是亟需解決的問題。隨著技術(shù)的發(fā)展，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的研究熱點[5]。CTNNB1基因編碼的β-catenin蛋白是Wnt信號通路的重要效應(yīng)分子，而Wnt信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過程，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[6]。目前研究[7]發(fā)現(xiàn)， CTNNB1作為癌基因與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中沉默CTNNB1可降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。在小鼠胰腺β細(xì)胞NIT-1通過激活Wnt/CTNNB1信號通路抑制細(xì)胞凋亡[9]。抑制CTNNB1能夠促進肝母細(xì)胞瘤HuH6細(xì)胞凋亡[10]。本實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CTNNB1 siRNA能夠顯著降低人卵巢癌HO8910細(xì)胞中CTNNB1 mRNA和蛋白表達水平，升高細(xì)胞凋亡率，說明抑制CTNNB1基因的表達可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡途徑[11]。XBP1和ATF4是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過程中極為重要的信號因子，目前認(rèn)為XBP1和ATF4相對表達量的升高能夠間接反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)CTNNB1的表達能夠促進HO8910細(xì)胞中XBP1和ATF4 mRNA的表達，提示下調(diào)CTNNB1基因表達可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外本實驗檢測了細(xì)胞中Caspase-3活性，結(jié)果顯示CTNNB1 siRNA組HO8910細(xì)胞中Caspase-3活性增加。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中扮演關(guān)鍵酶的作用[13]。以上實驗結(jié)果提示，下調(diào)卵巢癌HO8910細(xì)胞中CTNNB1基因的表達，可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、上調(diào)細(xì)胞中Caspase-3活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。