吳秋歌,李艷娟,馬東波,石 雁,張 輝,汪 洋

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 鄭州 450052 2)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 河南新鄉(xiāng) 453000

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是惡性腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關鍵[1]。EMT過程中，細胞上皮源性標記物的表達明顯下降，間葉源性標記物的表達增加[2]。上皮標記分子主要有E-鈣黏素(E-cadherin)和Desmoplakin等，間充質(zhì)細胞標記分子主要有波形蛋白(Vimentin)和Fibronectin等[3]。 Snail家族和Twist家族等可以通過與E-cadherin啟動子上的E-boxes結(jié)合，降低E-cadherin的表達水平[4-5]。 叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1(forkhead box C1，F(xiàn)OXC1)是FOX家族成員，與動物及人類多種重要器官的發(fā)育有關[6]。越來越多的研究[7-9]表明，F(xiàn)OXC1在多種惡性腫瘤組織中高水平表達，增強了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤能力，如乳腺癌、肝癌及惡性黑色素瘤等。 FOXC1高水平表達的已出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者生存期縮短[7]。FOXC1高表達的肝癌患者術后復發(fā)及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率更高[10]。該研究中，我們利用siRNA下調(diào)人肺腺癌A549細胞中FOXC1的表達，觀察細胞中E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達，以及細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的改變，探討FOXC1對肺腺癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。siRNA-FOXC1和陰性對照siRNA(siRNA-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。FOXC1、E-cadherin、Vimentin、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。兔抗人FOXC1多克隆抗體購于美國Abcam公司，兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人Vimentin抗體及兔抗人GAPDH抗體購于美國CST公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

1.2實驗分組將A549細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培育。每2～3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞，按每孔5×105個/mL接種于6孔板，當細胞融合率達60%～70%時，分3組處理?？瞻讓φ战M細胞不轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)；陰性對照組和siRNA-FOXC1組采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-FOXC1。

1.3細胞中FOXC1、E-cadherin及Vimentin mRNA的檢測轉(zhuǎn)染處理6 h后，采用實時熒光定量PCR法檢測細胞中 FOXC1、E-cadherin及Vimentin mRNA的表達水平。Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，按照PCR試劑盒說明書操作。FOXC1上游引物：5’-ATCACCCT GAACGGCATCTA-3’，下游5’-CTTGACGAAGCACTCGTTGA-3’；E-cadherin上游引物5’-TGGAGAGA CACTGCCAACTG-3’，下游5’-TTAGGGCTGTGTACGTGCTG-3’；Vimentin上游引物5’-GAAATTGCAGGAGGAGATGC-3’，下游5’-ATTCCACTTTGCGT TCAAGG-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物5’-ACCCA GAAGACTGTGGATGG-3’，下游5’-TTCAGCTCAGG GATGACCTT-3’。反應體系:上、下游引物各1 μL,5×擴增緩沖液5 μL,dNTP 1 μL,模板DNA 0.2 μg,Taq DNA聚合酶0.2 μL,1.5 mmol/L Mg2+1.5 μL,加雙蒸水至20 μL。反應條件:預變性95 ℃10 min；變性95 ℃10 s,退火60 ℃20 s；延伸72 ℃15 s；30個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算FOXC1、E-cadherin及Vimentin mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.4細胞中FOXC1、E-cadherin、Vimentin蛋白的檢測轉(zhuǎn)染處理6 h后，采用Western blot法檢測細胞中 FOXC1、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達水平。用RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白，用BCA法進行蛋白定量。蛋白經(jīng)煮沸處理后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉2 h，加一抗(FOXC1、E-cadherin、Vimentin和GAPDH抗體分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 500稀釋)4 ℃過夜，用TBST緩沖液于搖床上洗滌細胞5 min×3次，加二抗(按1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗滌細胞5 min×3次，電化學發(fā)光法顯色，顯影、定影。采用Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.5細胞侵襲能力的檢測轉(zhuǎn)染處理6 h后，采用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力。將60 μL Matrigel膠用300 mL的無血清培養(yǎng)基稀釋，在Transwell小室的上室加入100 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～5 h，直到變成固態(tài)。上室中接種1×105個細胞，下室中滴加500 μL含有體積分數(shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用戊二醛固定，結(jié)晶紫染色30 min,然后于顯微鏡下選擇4個高倍(400×)視野觀察并計數(shù)穿膜(侵襲)細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.6細胞遷移能力的檢測采用劃痕實驗。在6孔板底部畫出間隔為0.5 cm的兩條線。取對數(shù)生長期的A549細胞，稀釋成1×105個/mL的單細胞懸液，1 mL/孔接種于6孔板培養(yǎng)24 h，然后按1.2分3組處理，24 h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)到成單層細胞。用移液器槍頭在每孔底部中線處劃痕，PBS清洗，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察測量劃痕寬度并拍照。用Image J軟件打開圖片后隨機選取6條水平線，計算劃痕內(nèi)細胞間距離的均值。遷移率=(1-均值/劃痕寬度)×100%。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理選用SPSS21.0進行數(shù)據(jù)分析。3組各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.13組細胞中FOXC1表達的比較見圖1和表1。與siRNA-NC組和空白對照組比較，siRNA-FOXC1組FOXC1 mRNA及蛋白表達水平均降低，提示轉(zhuǎn)染有效。

圖1 3組細胞FOXC1、Vimentin、E-cadherin 蛋白的表達

表1 3組細胞中FOXC1 mRNA及蛋白表達水平的比較

2.23組細胞中E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達的比較見圖1和表2。與siRNA-NC組和空白對照組比較，siRNA-FOXC1組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平均增高，Vimentin mRNA和蛋白表達水平降低。

表2 3組細胞中E-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達水平的比較

2.33組細胞遷移和侵襲能力的比較劃痕實驗結(jié)果見圖2， 侵襲實驗結(jié)果見圖3。3組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)的比較見表3。siRNA-FOXC1組遷移率和侵襲細胞數(shù)均較空白組對照組和siRNA-NC組降低。

上：空白對照組；中：siRNA-NC組；下：siRNA-FOXC1組

A：空白對照組；B：siRNA-NC組；C：siRNA-FOXC1組

表3 3組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)的比較

3 討論

肺癌的發(fā)病率很高，其中肺腺癌的發(fā)病率最高，侵襲和轉(zhuǎn)移是預后差的最主要原因。EMT可以增加腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。E-cadherin參與細胞黏附、上皮結(jié)構穩(wěn)定性的維持，并且在促進胚胎組織生長、調(diào)節(jié)細胞間信息傳遞等過程中也起著十分重要的作用[11]。多種惡性腫瘤中存在EMT，并且E-cadherin的表達與腫瘤臨床分期呈負相關[12]。因此可以認為，E-cadherin低水平表達或缺失是EMT的典型標志[13]。Vimentin主要表達于內(nèi)皮細胞和一些間質(zhì)細胞，可介導調(diào)控多種細胞活動，參與惡性腫瘤新生血管形成、細胞轉(zhuǎn)移和黏附過程[14-15]，在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用。Vimentin在間質(zhì)來源的腫瘤細胞內(nèi)表達，在上皮來源的腫瘤細胞中不表達，在侵襲性腫瘤細胞系中表達增加，其表達與腫瘤的惡性程度有一定的關聯(lián)[16-17]，Vimentin高水平表達是腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲能力增高的標志之一。

FOXC1基因定位于人類染色體6p25，Hayashi等[11]報道FOXC1可通過不同的通路影響腫瘤細胞的遷移及侵襲。FOXC1可通過激活NF-κB信號通路促使乳腺癌細胞發(fā)生EMT，從而導致顱內(nèi)轉(zhuǎn)移[18]。上調(diào)乳腺癌細胞中FOXC1的表達可誘導EMT[19]。本研究發(fā)現(xiàn)A549細胞轉(zhuǎn)染siRNA-FOXC1后，Vimentin蛋白及mRNA表達明顯下降，E-cadherin的表達增加，細胞的遷移和侵襲能力均降低，提示沉默F(xiàn)OXC1可以在一定程度上抑制A549細胞的EMT，從而進一步抑制A549細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，F(xiàn)OXC1可能通過誘導肺腺癌細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力；抑制FOXC1的表達可以降低肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力。該結(jié)論為靶向FOXC1治療肺腺癌奠定了基礎。