黃朋偉，龐天寶，陳嘉捷，劉萍萍，崔新征，張清勇

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院重癥肌無力綜合診療中心 鄭州 450003

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AChR)抗體介導(dǎo)、T細胞依賴的自身免疫性疾病[1]。目前治療方法主要包括藥物治療及胸腺切除，但其發(fā)病機制尚未明確。非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)(non-neuronal cholinergic system,NNCS)是一種存在于上皮細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞等細胞中完整的、獨立的膽堿能系統(tǒng)，包括毒蕈堿型受體(mAChR, M1～M5)，煙堿型受體(nAChR, α1～α10、β1～β4、γ)，合成乙酰膽堿的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶以及分解乙酰膽堿的乙酰膽堿酯酶等[2]。Kawashima等[3]已證實該系統(tǒng)在免疫細胞上表達且通過自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)免疫功能。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)激活α7 nAChR可增強T細胞的免疫抑制功能，抑制免疫細胞炎性因子的釋放。本研究主要檢測了MG患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中α7 nAChR的表達，并在T細胞活化的基礎(chǔ)上，進行α7 nAChR拮抗/激活干預(yù)，觀察α7 nAChR對T細胞增殖及相關(guān)細胞因子表達的影響，為后續(xù)研究其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2018年9月至2019年3月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的MG患者共20例，年齡9～63(31.2±7.9)歲，男女各10例?；颊呔鶕?jù)臨床癥狀、新斯的明試驗、乙酰膽堿受體抗體、重頻刺激試驗、肌電圖和胸部CT確診為MG，排除其他自身免疫性疾病、嚴重感染、嚴重器官不全等的患者，排除服用溴吡斯的明片，服用激素或其他免疫抑制劑者。選取鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢人員(無自身免疫性疾病、嚴重感染，未服用激素或免疫抑制劑等)20例為健康對照，年齡14～55(30.4±6.8)歲，男女各10例。該研究得到鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，患者及體檢人員均簽署知情同意書。

1.2主要儀器和試劑流式細胞儀(BD公司，型號：Accuri C6)、RT-2100C酶聯(lián)免疫檢測儀(Rayto公司)、實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)?？谷薈D3單抗、抗人CD28單抗、抗CD8-APC抗體、抗CD4-PE抗體(Invitrogen公司)，抗人α7 nAChR抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(Biolengd公司)，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12 ELISA檢測試劑盒(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)，熒光染料CFSE、Trizol(Invitrogen公司)，α7 nAChR激動劑、α7 nAChR拮抗劑(APExBIO公司)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成。

1.3樣本采集、PBMC及血清的分離抽取MG患者組和健康對照組肘正中靜脈血共8 mL(6 mL置于肝素抗凝管)，抗凝試管血與PBS 1∶1混勻，加入等體積細胞分離液，1 500 r/min離心20 min，PBS洗滌2次后得PBMC；取未抗凝血樣，離心收集血清，-80 ℃保存，用于細胞因子的檢測。

1.4PBMC中α7nAChR mRNA的檢測用Trizol提取PBMC總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行α7 nAChR熒光定量PCR，內(nèi)參選管家基因GAPDH，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，0.3 μmol/L上下游引物各0.5 μL，Taq-Mix 5 μL，H2O 3 μL。按2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.5PBMC中α7nAChR蛋白的檢測從分離的PBMC中提取蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下BSA封閉2 h，加入α7 nAChR抗體(按1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗后，室溫下加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG孵育1 h。ECL法顯色。用Image-Pro Plus 6.0分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6外周血細胞因子水平的檢測采用ELISA檢測MG患者組和健康對照組血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平，具體操作按說明書進行。

1.7PBMC的標記、T細胞的活化及處理取MG患者PBMC，用PBS調(diào)整細胞密度為1×107個/mL，加入終濃度為2.5 μmol/L的CFSE進行染色，用RPMI 1640重懸細胞。在CFSE標記的MG患者的PBMC中，加入抗人CD3單抗(終質(zhì)量濃度1 mg/L)和抗人CD28單抗(終質(zhì)量濃度0.5 mg/L)活化T細胞，接種于24孔板，調(diào)整細胞密度為3×105個/孔，分別加入PBS(空白對照組)、α7 nAChR拮抗劑(拮抗劑組，終濃度10 μmol/L)、α7 nAChR激動劑(激動劑組，終濃度10 μmol/L)，用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.8T細胞培養(yǎng)液上清細胞因子水平及增殖活性的檢測①收集3組細胞，4 000 r/min離心3 min，吸取培養(yǎng)液上清，采用ELISA檢測IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平，具體操作按說明書步驟進行。②用PBS洗滌細胞，加50 μL 緩沖液重懸細胞，分別加入抗CD4-PE抗體和抗CD8-APC抗體，4 ℃孵育30 min，4 000 r/min離心3 min，棄上清，加入200 μL緩沖液重懸，上流式細胞儀檢測。未刺激的細胞具有較強CFSE的染色熒光(單峰)；抗CD3/CD28誘導(dǎo)活化后，增殖的淋巴細胞出現(xiàn)逐漸遞減的CFSE染色熒光(多峰)，圈門并統(tǒng)計各組增殖情況。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較健康對照組和MG患者組α7 nAChR表達及血清相關(guān)細胞因子水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗比較3組T細胞亞群增殖及細胞因子水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1MG患者組與健康對照組PBMC中α7nAChR表達水平的比較與健康對照組相比，MG患者組PBMC中α7 nAChR mRNA及蛋白的表達水平均降低(P<0.001)(圖1、表2)。

表2 2組PBMC中α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平的比較

2.2MG患者組與健康對照組血清細胞因子水平的比較與健康對照組相比，MG患者組血清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12水平升高(P<0.001)，而IL-4、IL-10水平2組間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 2組血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平的比較 ng/L

2.3α7nAChR對MG患者T細胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平的影響與空白對照組相比，α7 nAChR拮抗劑組培養(yǎng)液上清IFN-γ、TNF-α、IL-6水平升高，α7 nAChR激動劑組IFN-γ、TNF-α、IL-6水平則降低(P<0.05)；IL-4、IL-10、IL-12在3組中的水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 3組培養(yǎng)液上清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12水平的比較 ng/L

2.4α7nAChR對MG患者T細胞亞群增殖的影響與空白對照組相比，α7 nAChR拮抗劑組T細胞亞群增殖增強，而α7 nAChR激動劑組T細胞亞群增殖減弱(P<0.05)(表5)。

1：健康對照組；2：MG患者組

表5 3組T細胞亞群增殖率的比較 %

3 討論

MG是發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭處、AChR抗體介導(dǎo)的、補體參與的自身免疫性疾病[6]。通常采用藥物治療效果不佳時，胸腺切除術(shù)亦為一種有效的治療手段。MG新的治療方法也在不斷探索中。隨著對NNCS的深入研究，越來越多的證據(jù)證明α7 nAChR在抗炎和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Schubert等[7]發(fā)現(xiàn)α7 nAChR在關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中起免疫調(diào)節(jié)作用，與此同時，Skok等[8]發(fā)現(xiàn)激活α7 nAChR可增強骨髓中B細胞的存活，表明α7 nAChR在調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。王金榮等[9]發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎大鼠PBMC中α7 nAChR表達水平顯著降低，且與病情程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示MG患者PBMC中α7 nAChR mRNA及蛋白的表達水平均低于正常個體，由此猜測α7 nAChR與MG的發(fā)病有關(guān)。

研究[10-11]表明CD4+T細胞參與MG的發(fā)病，特別是Th1細胞和Th2細胞，如Th1細胞能誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生與補體結(jié)合的抗體。另外查閱文獻[12]發(fā)現(xiàn)，在實驗性自身免疫性MG(EAMG)小鼠中注射重組IFN-γ，結(jié)果癥狀更重，AChR抗體滴度更高。管宇宙等[13]發(fā)現(xiàn)MG患者治療后，血清TNF-α下降，原因可能是TNF-α通過巨噬細胞及其他神經(jīng)肌肉接頭浸潤細胞參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。Eilertsen等[14]發(fā)現(xiàn)IL-6在B細胞增殖和分化過程中具有調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)B細胞分泌多克隆IgG。且以往研究[15]發(fā)現(xiàn)MG患者血清中IL-12水平升高，激素階段性治療后，IL-12水平下降，這些結(jié)果表明可能是AChR自身抗原刺激免疫系統(tǒng)，使Th1/Th2平衡失調(diào)，引起細胞因子分泌異常，參與MG的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)MG患者α7 nAChR表達水平降低，同時血清中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12水平升高。為進一步證實兩者之間的關(guān)系，體外活化MG患者外周T細胞，并對α7 nAChR進行拮抗或激活處理，發(fā)現(xiàn)加入α7 nAChR拮抗劑后，上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-6水平升高，相反，加入α7 nAChR激動劑后，IFN-γ、TNF-α、IL-6水平降低；且加入α7 nAChR拮抗后，T細胞增殖增強，反之，T細胞增殖受抑，表明α7 nAChR可能參與調(diào)控T細胞增殖。以上數(shù)據(jù)表明，α7 nAChR可能通過激活某個信號通路參與調(diào)控MG的發(fā)病。

總之，MG患者中α7 nAChR的表達異?？赡苡绊慣細胞的增殖及細胞因子的水平，從而參與MG的發(fā)?。辉撗芯繛楹罄m(xù)深入研究α7 nAChR在MG發(fā)病機制中的作用提供了新的視角，同時可能為MG的診斷及治療提供新的靶點。