謝南昌，李英嬌，王 翠，連亞軍，孟祥荷，李鈺娟，杜麗媛

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科 鄭州 450052

癲癇是僅次于腦血管病的神經(jīng)系統(tǒng)常見病，我國癲癇患者超過900萬，且每年新增病例(40～70)萬，給社會(huì)、家庭及患者都帶來沉重負(fù)擔(dān)。最近研究[1-2]表明線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞代謝、生存中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡在癲癇引起的神經(jīng)元損傷中扮演重要角色[3]。線粒體主要通過其內(nèi)膜上的線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter, MCU) 對細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行攝取，MCU在細(xì)胞和線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是鈣離子儲(chǔ)存、調(diào)節(jié)及蛋白加工的重要場所，各種細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變?nèi)缪趸瘧?yīng)激狀態(tài)、鈣離子紊亂等，均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[5]。ERS時(shí)通過增加ERS相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulating protein 78, GRP78)的表達(dá)促進(jìn)蛋白正確折疊、協(xié)助錯(cuò)誤折疊蛋白轉(zhuǎn)移以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。但當(dāng)ERS過于強(qiáng)烈或持久，超過細(xì)胞負(fù)荷時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，引起相關(guān)凋亡分子CHOP(C/EBP homologous protein, CHOP)和Caspase-12的表達(dá)上調(diào)[6-7]。我們前期研究[8]發(fā)現(xiàn)MCU在匹魯卡品誘導(dǎo)的急性顳葉癲癇大鼠海馬神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用。

多項(xiàng)研究[9-10]表明體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元在無鎂細(xì)胞外液中培養(yǎng)3 h可形成穩(wěn)定的癲癇樣放電，并且恢復(fù)正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后仍存在自發(fā)的癲癇樣放電，其為癲癇發(fā)病機(jī)制的研究提供了理想的模型。在本研究中，我們采用MCU特異性抑制劑Ru360、激動(dòng)劑精胺(Spermine)以及線粒體靶向抗氧化劑Mito-Q預(yù)處理大鼠無鎂致癇海馬神經(jīng)元，探討MCU在癲癇神經(jīng)元凋亡中的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取新生24 h以內(nèi)的SPF級SD大鼠100只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0004。依據(jù)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求進(jìn)行手術(shù)操作。

1.1.2 主要試劑 Ru360(美國 Sigma公司)，Spermine(美國Millipore公司)，Mito-Q(美國MedChemExpress公司)，使用時(shí)均溶解于無菌生理鹽水中。胰蛋白酶、MTT試劑盒(美國 Sigma公司)；TUNEL 試劑盒(德國Roche公司)；鈣離子熒光探針 Rhod-2(美國Life Technologies公司)，線粒體MitoSOX 熒光探針(美國Invitrogen公司)；青鏈霉素混合液、L-多聚賴氨酸、RIPA裂解液(北京索來寶科技有限公司)；NSE抗體(武漢博士德生物公司)，β-actin抗體(武漢三鷹公司)，GRP78、CHOP和Caspase-12抗體(美國CST公司)；Neurobasal-A培養(yǎng)基、特級胎牛血清、B27、L-谷氨酰胺(美國Gibco公司)；DMEM(美國Hyclone公司)。

1.2海馬神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)及鑒定將新生24 h內(nèi)的SD大鼠在乙醇中浸泡消毒1 min左右，在超凈工作臺(tái)上斷頭取腦，分離取出海馬并去除其表面血管膜。將海馬轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入DMEM及2.5 g/L胰蛋白酶各2 mL，混勻后放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15 min，每5 min搖晃數(shù)次。消化結(jié)束后將組織轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中并加入等體積的種植培養(yǎng)基(以體積分?jǐn)?shù)89%DMEM、10%特級胎牛血清和1%青鏈霉素混合液構(gòu)成)終止消化，反復(fù)吹打后1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入種植培養(yǎng)基，再次離心棄上清，加入適量種植培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)3.5×105個(gè)/mL，種植到預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后更換為維持培養(yǎng)基(以體積分?jǐn)?shù)96%Neurobasal-A培養(yǎng)基、2%的B27、1%青鏈霉素混合液和1%谷氨酰胺構(gòu)成)繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d半量換液1次。培養(yǎng)至第7 d，NSE免疫熒光染色法鑒定。

1.3Ru360和Spermine對無鎂致癇海馬神經(jīng)元凋亡的作用及機(jī)制探討

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將培養(yǎng)至14 d的海馬神經(jīng)元分為空白對照組、無鎂誘導(dǎo)組、Ru360組、Spermine組?？瞻讓φ战M用正常的含鎂細(xì)胞外液處理3 h后，用維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。無鎂誘導(dǎo)組用無鎂細(xì)胞外液處理3 h后，用維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。Ru360組和Spermine組分別用5 μmol/L的Ru360和10 μmol/L的Spermine處理1 h[11]，然后用無鎂細(xì)胞外液處理3 h[9-10]，再用維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 神經(jīng)元活力檢測 海馬神經(jīng)元分組處理并維持培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，在37 ℃孵育4 h后吸出液體，向每孔加入150 μL的DMSO，在搖床上搖晃15 min后用酶標(biāo)儀測定吸光度值。以實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照孔吸光度值表示神經(jīng)元存活率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.3 神經(jīng)元凋亡檢測 海馬神經(jīng)元分組處理并維持培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，多聚甲醛固定30 min，TritonX-100處理5 min，每孔加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，陰性對照僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對照加入100 μL DNase 1于37 ℃反應(yīng)1 h。加入50 μL標(biāo)記有熒光素抗體的辣根過氧化酶，于37 ℃反應(yīng)30 min后，加入50～100 μL的DAB底物反應(yīng)20 min，蘇木精復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野觀察，計(jì)算陽性細(xì)胞(呈深棕色)占總細(xì)胞的百分比，即神經(jīng)元凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.4 神經(jīng)元線粒體鈣離子濃度和ROS生成水平測定 海馬神經(jīng)元分組處理并維持培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基用HEPES浸洗3次，加11 μmol/L的Rhod-2 孵育15 min，用分光光度計(jì)在激發(fā)波長575 nm和發(fā)射波長605 nm條件下檢測熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度代表神經(jīng)元內(nèi)線粒體鈣離子濃度。分組處理并維持培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入 5 μmol/L的MitoSOX工作液2 mL,在37 ℃避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測，以熒光強(qiáng)度表示ROS生成水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.5 神經(jīng)元中ERS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 海馬神經(jīng)元分組處理并維持培養(yǎng)24 h后，用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并用BCA法定量。上樣25 μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別加入GRP78(1∶1 000)、CHOP(1∶500) 、Caspase-12(1∶1 000)和β-actin(1∶3 000)抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗5 min×3次，加入二抗室溫下孵育1 h，TBST洗5 min×3次。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯像，用圖像系統(tǒng)掃描，并用Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4Mito-Q對無鎂致癇海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成和ERS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響海馬神經(jīng)元培養(yǎng)14 d后，分為空白對照組、無鎂誘導(dǎo)組和Mito-Q組。Mito-Q組預(yù)先用500 nmol/L的Mito-Q處理1 h[12-13]，然后用無鎂細(xì)胞外液處理3 h；其他兩組處理方法同1.3.1。分組處理并維持培養(yǎng)24 h后，檢測神經(jīng)元中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白的表達(dá)及線粒體ROS生成水平，方法同前。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間上述各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1原代海馬神經(jīng)元的鑒定原代海馬神經(jīng)元分離后培養(yǎng)至第7天，NSE免疫熒光染色后在熒光顯微鏡下可觀察到呈紅色熒光的胞質(zhì)和樹突，呈藍(lán)色熒光的胞核(圖1)，神經(jīng)元純度達(dá)95%以上。

圖1 原代海馬神經(jīng)元的鑒定

2.2對照組、無鎂誘導(dǎo)組、Ru360組、Spermine組神經(jīng)元存活率、凋亡率的比較見圖2和表1。與空白對照組相比較，無鎂誘導(dǎo)組海馬神經(jīng)元存活率降低，凋亡率增加(P<0.05)。與無鎂誘導(dǎo)組比較，Ru360組神經(jīng)元存活率增加，凋亡率降低；而Spermine組海馬神經(jīng)元存活率降低，凋亡率增加(P<0.05)。

A:空白對照組;B:無鎂誘導(dǎo)組;C:Ru360組;D:Spermine組

表1 4組海馬神經(jīng)元存活率和凋亡率的比較

2.3對照組、無鎂誘導(dǎo)組、Ru360組、Spermine組線粒體鈣離子濃度和ROS生成水平的比較如表2所示，與空白對照組相比，無鎂誘導(dǎo)組海馬神經(jīng)元線粒體鈣離子濃度和ROS生成水平增加(P<0.05)。與無鎂誘導(dǎo)組相比，Ru360組線粒體鈣離子濃度和ROS生成水平降低，而Spermine組均升高(P<0.05)。

表2 4組線粒體鈣離子濃度和ROS生成水平的比較

2.4對照組、無鎂誘導(dǎo)組、Ru360組、Spermine組ERS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較如圖3、表3所示，與空白對照組相比，無鎂誘導(dǎo)組海馬神經(jīng)元GRP78、CHOP和Caspase-12表達(dá)水平增加(P<0.05)。與無鎂誘導(dǎo)組相比，Ru360組GRP78、CHOP和Caspase-12表達(dá)水平降低，而Spermine組表達(dá)水平升高(P<0.05)。

表3 4組海馬神經(jīng)元中ERS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

2.5對照組、無鎂誘導(dǎo)組和Mito-Q組線粒體ROS生成水平和ERS通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較如圖4和表4所示，與無鎂誘導(dǎo)組相比，Mito-Q組線粒體ROS生成水平及GRP78、CHOP和Caspase-12表達(dá)水平降低(P<0.05)。

表4 3組ERS通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和線粒體ROS生成水平的比較

3 討論

近年來研究[14]表明鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡與癲癇的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。癲癇發(fā)作可使過多的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而線粒體可通過攝取細(xì)胞內(nèi)過多的鈣離子從而降低細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，以發(fā)揮代償作用。但線粒體鈣超載又可導(dǎo)致ROS過度生成、線粒體通透性增加、跨膜電位下降、細(xì)胞色素C釋放等，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，體外無鎂致癲大鼠海馬神經(jīng)元中線粒體鈣離子濃度、ROS生成量及神經(jīng)元凋亡明顯增加；MCU抑制劑Ru360可明顯減輕模型細(xì)胞線粒體鈣超載及ROS生成水平，降低神經(jīng)元凋亡率，而MCU激動(dòng)劑Spermine的作用與Ru360相反。以往研究[17]發(fā)現(xiàn)Spermine可以增加缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，這與本研究結(jié)果一致。但是最近研究發(fā)現(xiàn)Spermine抑制Pb2+誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，而Ru360則發(fā)揮相反作用。雖然MCU對氧化應(yīng)激的影響有待進(jìn)一步研究，但相關(guān)研究均表明MCU在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

癲癇可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失衡，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白大量累積，發(fā)生ERS[18]。ERS時(shí)，GRP78蛋白表達(dá)上調(diào)以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，然而當(dāng)ERS過于強(qiáng)烈或持久，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)CHOP和Caspase-12通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。CHOP通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Caspase-12則通過活化Caspase-9、Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-21]。以往研究表明線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互串話和相互作用在凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)無鎂致癲大鼠海馬神經(jīng)元中GRP78、CHOP及Caspase-12表達(dá)均增加，提示癲癇激活了海馬神經(jīng)元的ERS；Ru360可顯著抑制模型神經(jīng)元中GRP78、CHOP及Caspase-12的表達(dá)，而Spermine則增加了GRP78、CHOP及Caspase-12的表達(dá)；表明MCU 調(diào)控的ERS在癲癇誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用。

研究[22]表明線粒體氧化應(yīng)激和ERS密切相關(guān)。線粒體是內(nèi)源性自由基的主要來源，線粒體鈣超載可引起線粒體ROS過度產(chǎn)生，而ROS又會(huì)導(dǎo)致ERS[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)線粒體靶向抗氧化劑Mito-Q預(yù)處理可明顯降低無鎂致癲大鼠海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成水平，降低GRP78、CHOP和Caspase-12的表達(dá)，說明線粒體氧化應(yīng)激在癲癇誘導(dǎo)的ERS中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)抑制MCU可以減輕癲癇誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，而激動(dòng)MCU則促進(jìn)癲癇誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，其潛在機(jī)制可能與調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ERS有關(guān)。因此，選擇性地調(diào)控MCU可能是癲癇治療的新思路。

1: 空白對照組; 2: 無鎂誘導(dǎo)組; 3: Ru360組; 4: Spermine組

1: 空白對照組; 2: 無鎂誘導(dǎo)組; 3: Mito-Q組