王亦如， 楊夢(mèng)瑩， 陽(yáng)志軍△

1廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院婦科，南寧 5300212廣西醫(yī)科大學(xué)區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是常見的婦科惡性腫瘤，其結(jié)局取決于早期診斷和治療，然而卵巢癌起病隱匿、疾病進(jìn)展較快，影響患者預(yù)后。卵巢癌的一線療法基于腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和鉑類藥物化療，而高復(fù)發(fā)率和鉑耐藥是當(dāng)前面臨的臨床難題，貝伐單抗和PARP抑制劑的有效應(yīng)用進(jìn)一步提示靶向精準(zhǔn)治療的必要性[1-2]。近年來，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在炎癥和腫瘤[3]、腫瘤微環(huán)境[4]、腫瘤細(xì)胞凋亡抑制[5]等生物學(xué)過程中的作用得到印證，STAT3靶向抑制劑WP1066[6]、S3I-201[7]在減緩腫瘤進(jìn)展和增強(qiáng)化療藥物敏感性中的作用取得初步進(jìn)展，但其機(jī)制和精準(zhǔn)靶點(diǎn)有待進(jìn)一步探索。維甲酸-干擾素誘導(dǎo)死亡相關(guān)基因19(the genes-associated with retinoid-interferon induced mortality-19，Grim19)，又名Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物13(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 13，NDUFA13)，一方面作為線粒體復(fù)合體Ⅰ的輔助亞基參與線粒體代謝，同時(shí)特異地與STAT3相互作用影響腫瘤進(jìn)展[8]，是可能的腫瘤治療靶點(diǎn)，但其作用機(jī)制并不明確。本研究旨在通過生物信息學(xué)分析，結(jié)合卵巢癌臨床資料和完整基因芯片信息篩選STAT3、Grim19的相關(guān)基因，并富集相關(guān)基因，挖掘STAT3、Grim19的臨床價(jià)值與潛在的功能、機(jī)制，為進(jìn)一步研究二者在卵巢癌疾病中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 STAT3、Grim19生物信息學(xué)分析

1.1.1 獲取STAT3、Grim19的基本信息 利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UCSC(http：//genome.ucsc.edu/)、UniProt(https：//www.uniprot.org/)等在線數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索STAT3、Grim19的序列號(hào)、染色體定位等基本信息。

1.1.2 PubMed檢索STAT3、Grim19相關(guān)文獻(xiàn) 在PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)，分別以STAT3、Grim19作為關(guān)鍵詞檢索，仔細(xì)閱讀并篩選與STAT3、Grim19相關(guān)的研究文獻(xiàn)。

1.1.3 GEPIA在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)卵巢癌臨床病例中STAT3、Grim19蛋白之間相關(guān)性 利用GEPIA軟件(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)426例卵巢癌的資料信息，采用Pearson檢驗(yàn)分析STAT3、Grim19在卵巢癌中表達(dá)的相關(guān)性，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05[9]。

1.1.4 臨床病例數(shù)據(jù)來源及生存分析 使用LinkedOmics在線軟件(http：//www.linkedomics.org/login.php/)[10]下載卵巢癌mRNA的TCGA數(shù)據(jù)集，篩選出包含STAT3表達(dá)量的臨床病例294例，按照STAT3表達(dá)水平由高到低排列，將表達(dá)水平位于前50%的病例作為高表達(dá)組(n=147)，后50%作為低表達(dá)組(n=147)，應(yīng)用SPSS 26繪制Kaplan-Meier生存曲線；篩選包含Grim19表達(dá)量的臨床病例549例，將表達(dá)水平前50%病例作為高表達(dá)組(n=275)，后50%作為低表達(dá)組(n=274)，應(yīng)用SPSS 26繪制繪制Kaplan-Meier生存曲線，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.1.5 STAT3、Grim19相關(guān)基因篩選 使用LinkedOmics在線工具(http：//www.linkedomics.org/login.php)下載包含STAT3、Grim19表達(dá)水平的基因芯片卵巢癌數(shù)據(jù)集，共檢測(cè)基因6426個(gè)，使用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行篩選，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，利用LinkedOmics在線軟件分別選取正負(fù)相關(guān)基因各50個(gè)，繪制火山圖[10]。

1.1.6 STAT3、Grim19的GO分析和KEGG分析將篩選出與STAT3、Grim19相關(guān)的基因，按照相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值排列，取與STAT3關(guān)系最強(qiáng)基因136個(gè)，與Grim19關(guān)系最強(qiáng)基因124個(gè)，轉(zhuǎn)換基因名稱，利用Omicshare(https：//www.omicshare.com/tools/)在線軟件，進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集分析，選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.2 免疫組化法檢測(cè)STAT3、Grim19表達(dá)水平及預(yù)后分析

收集2013年1月～2017年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者組織標(biāo)本115例，患者平均年齡為(55.44±1.02)歲。所有患者經(jīng)術(shù)中冰凍切片及術(shù)后病理確診為上皮性卵巢癌，WHO組織學(xué)分型以漿液性囊腺癌為主，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ～Ⅳ期，治療方式分為PDS+化療和NACT+IDS。所取標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診且擁有完整病歷資料，并獲患者知情同意及獲廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。免疫組化試劑盒購(gòu)于CST公司(美國(guó))，STAT3、Grim19抗體購(gòu)于Abcam公司(英國(guó))，按照免疫組化試劑盒操作流程測(cè)定STAT3、Grim19在上皮性卵巢癌中的表達(dá)，采用Image J進(jìn)行定量分析，采用SPSS 26進(jìn)行生存分析，生存曲線采用Kaplan-Meier分析法，使用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用Cox模型進(jìn)行多變量分析，判定影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)、Spearman檢驗(yàn)；生存曲線采用Kaplan-Meier分析法，多變量分析采用Cox模型，選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 STAT3、Grim19的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 STAT3、Grim19的基本信息 通過檢索NCBI、UCSC、UniProt等在線數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)STAT3序列號(hào)為NC_000017.11，定位于染色體17q21.2區(qū)域中的一個(gè)簇內(nèi)，其成熟基因位點(diǎn)在Chr17：42，313，324-42，388，502；Grim19又稱NDUFA13，序列號(hào)為NC_000019.10，定位于染色體19p13.11區(qū)域中的一個(gè)簇內(nèi)，其成熟基因位點(diǎn)在Chr19：19，516，225-19，528，198(表1)。

表1 STAT3、Grim19的基本信息Table 1 Basic information of STAT3 and Grim19

2.1.2 STAT3及Grim19參與的疾病調(diào)控 通過PubMed檢索STAT3、Grim19相關(guān)文獻(xiàn)[11-50]發(fā)現(xiàn)：STAT3的表達(dá)具有組織特異性，STAT3在乳腺癌[11-12]、宮頸癌[13-14]、肺癌[15-16]、卵巢癌[17-18]、胃癌[19-20]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[21-22]、前列腺癌[23，47]、結(jié)直腸癌[24-25]、膀胱癌[26-27]、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤[28-30]、阿爾茨海默病[31]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[32]等疾病中表達(dá)上調(diào)，經(jīng)由JAK/STAT3、IL-6/STAT3、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、NF-κB/Bcl-2等信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡、遷移、增殖、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤干細(xì)胞生成、炎癥反應(yīng)、腫瘤微環(huán)境、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種生物學(xué)過程，見表2。Grim19在乳腺癌[33]、宮頸癌[34]、肺癌[35]、肝癌[36-37]、膀胱癌[38]、腎癌[39]、結(jié)直腸癌[40]、甲狀腺癌[41-42]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌[43]、子宮腺肌癥[44]、原因不明反復(fù)流產(chǎn)[45]、弱精子癥[46]等疾病中表達(dá)下調(diào)，主要與STAT3相互作用參與細(xì)胞凋亡、遷移、增殖、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等生物學(xué)過程，見表3。

表2 Pubmed檢索STAT3參與調(diào)控的疾病與相關(guān)信息Table 2 Diseases regulated by STATS signaling pathway from PubMed searches

表3 Pubmed檢索Grim19參與調(diào)控的疾病與相關(guān)信息Table 3 Diseases regulated by Grim19 signaling pathway from PubMed searches

2.1.3 STAT3、Grim19蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 利用GEIPA在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)426例卵巢癌臨床病例，結(jié)果顯示STAT3、Grim19蛋白表達(dá)在卵巢癌中存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，即Grim19隨著STAT3表達(dá)的升高而降低，r=-0.29，P<0.05(圖1)。

圖1 STAT3、Grim19表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.1 The correlation analysis of expression of STAT3 and Grim19

2.1.4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析STAT3、Grim19表達(dá)水平對(duì)臨床病例預(yù)后的影響 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)分析顯示：在294例卵巢癌患者中，STAT3高表達(dá)組的中位生存時(shí)間與低表達(dá)組無(wú)明顯差異(P>0.05)；在549例卵巢癌患者中，Grim19高表達(dá)組的中位生存時(shí)間大于低表達(dá)組(P<0.05)，Grim19表達(dá)水平對(duì)患者的預(yù)后有影響(圖2)。

2.1.5 STAT3、Grim19相關(guān)基因篩選結(jié)果 在294例表達(dá)STAT3的基因芯片臨床數(shù)據(jù)集中，2785個(gè)基因與STAT3具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與STAT3呈正、負(fù)相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較高的50個(gè)基因依次為DNAAF2、SLC34A2、FAM134C、UNQ6490、TOM1等，其中與STAT3相關(guān)性系數(shù)最高(rs=-0.42，P<0.05)的基因?yàn)檠b配因子2(the dynein axonemal assembly factor 2，DNAAF2)，又名C14orf104，是一種蛋白激酶，參與軸突動(dòng)力蛋白裝配，在纖毛和鞭毛運(yùn)動(dòng)中起核心作用。在594例表達(dá)Grim19的基因芯片數(shù)據(jù)集中，4960個(gè)基因與Grim19具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Grim19呈正、負(fù)相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較高的50個(gè)基因依次為NDUFB7、MRPL34、C19orf14、MGC3194、P117等，其中與Grim19相關(guān)性系數(shù)最高(rs=0.75，P<0.01)的基因?yàn)镹ADH脫氫酶1β復(fù)合體亞基7(NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit B7，NDUFB7)，NDUFB7是線粒體復(fù)合體Ⅰ的輔助亞基，在線粒體氧化呼吸鏈電子傳遞中起重要作用(圖3)。

A：STAT3高表達(dá)組與低表達(dá)組對(duì)患者遠(yuǎn)期生存的影響；B：Grim19高表達(dá)組與低表達(dá)組對(duì)患者遠(yuǎn)期生存的影響圖2 TCGA臨床病例STAT3、Grim19表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響Fig.2 Effect of expression levels of STAT3 and Grim19 on the prognosis based on TCGA database

A：STAT3相關(guān)基因火山圖；B：Grim19相關(guān)基因火山圖圖3 STAT3、Grim19的相關(guān)基因火山圖Fig.3 The related gene heatmaps of STAT3 and Grim19

2.1.6 STAT3、Grim19的GO分析和KEGG分析GO功能注釋富集分析結(jié)果顯示，STAT3主要涉及的生物學(xué)學(xué)過程(biological process)為細(xì)胞過程、單一生物過程、代謝過程、刺激反應(yīng)等；主要涉及的分子功能(molecular function)為結(jié)合、催化活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等；主要涉及的細(xì)胞組分(cellular component)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞器等。Grim19主要涉及的生物學(xué)過程為細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞組分組織或合成等；主要涉及的分子功能為結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性等；主要涉及的細(xì)胞組分為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器等(圖4)。

KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，STAT3信號(hào)通路主要參與的細(xì)胞過程為運(yùn)輸和分解代謝，作用的機(jī)體系統(tǒng)為免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在傳染病和惡性腫瘤中作用明顯；KEGG信號(hào)通路富集發(fā)現(xiàn)STAT3主要作用在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、補(bǔ)體途徑、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等信號(hào)通路中。Grim19信號(hào)通路在神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)分泌和新陳代謝疾病、惡性腫瘤中作用明顯，參與多種生物代謝過程，如能量代謝、核苷酸代謝等，作用的機(jī)體系統(tǒng)多為環(huán)境適應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)，在遺傳信息處理中發(fā)揮重要作用；KEGG信號(hào)通路富集發(fā)現(xiàn)Grim19主要作用在亨廷頓病、氧化磷酸化、帕金森綜合征、非酒精性脂肪肝病等信號(hào)通路中(圖5)。

A：STAT3相關(guān)基因GO功能注釋中關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的20個(gè)功能；B：Grim19相關(guān)基因GO功能注釋中關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的20個(gè)功能圖4 STAT3、Grim19相關(guān)基因GO功能注釋Fig.4 The GO term of STAT3 and Grim19 genes

2.2 免疫組化法檢測(cè)臨床樣本中STAT3、Grim19的表達(dá)水平及預(yù)后分析

將免疫組化測(cè)得的115例上皮性卵巢癌樣本STAT3、Grim19表達(dá)水平按照從低到高排列，位于前50%的患者為低表達(dá)組(58例)，余為高表達(dá)組(57例)。低表達(dá)組平均STAT3水平為(56.20±9.65)，高表達(dá)組為(78.85±6.15)；平均Grim19表達(dá)水平，低表達(dá)組為(8.37±3.23)，高表達(dá)組為(18.88±3.97)。STAT3、Grim19高表達(dá)組的中位生存時(shí)間與低表達(dá)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見圖6。

A：STAT3表達(dá)水平對(duì)患者遠(yuǎn)期生存的影響；B：Grim19表達(dá)水平對(duì)患者遠(yuǎn)期生存的影響圖6 115例上皮性卵巢癌患者STAT3、Grim19表達(dá)水平對(duì)患者遠(yuǎn)期生存的影響Fig.6 Effect of STAT3 and Grim19 expression levels on overall survival rate of 115 patients with epithelial ovarian cancer

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析115例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本STAT3、Grim19的表達(dá)水平及臨床病理參數(shù)(年齡、FIGO分期、WHO組織學(xué)分型、治療方式)與預(yù)后之間的相關(guān)性，以評(píng)估影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果表明，年齡可能是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P<0.05，HR=0.348，95%可信區(qū)間為(0.171，0.706)。

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及對(duì)患者預(yù)后的影響與細(xì)胞內(nèi)異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)緊密相關(guān)，而與炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制、腫瘤微環(huán)境等生物過程相關(guān)的信號(hào)通路是影響腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同信號(hào)通路交織成網(wǎng)，受多種靶點(diǎn)影響[51-52]。STAT3作為多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)調(diào)控著機(jī)體的生物學(xué)過程，本研究通過對(duì)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，STAT3在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中普遍上調(diào)，經(jīng)由JAK/STAT3信號(hào)通路過度激活，形成磷酸二聚體轉(zhuǎn)入核內(nèi)對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)揮腫瘤細(xì)胞凋亡抑制作用[53]。STAT3經(jīng)由IL-6/STAT3、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、NF-κB/Bcl-2等信號(hào)通路影響惡性腫瘤的進(jìn)展，參與遷移、增殖、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤干細(xì)胞生成、炎癥反應(yīng)、腫瘤微環(huán)境、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種生物學(xué)過程。靶向STAT3的抑制劑在延緩腫瘤進(jìn)程和增強(qiáng)化療敏感性中作用的部分發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索STAT3在臨床治療上的應(yīng)用提供了依據(jù)[54]。

Grim19(NDUFA13)是一種新型的癌癥抑制基因，參與線粒體氧化代謝并特異性作用于STAT3[8，55]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Grim19在上皮性卵巢癌中表達(dá)明顯低于對(duì)照卵巢組織，STAT3在上皮性卵巢癌中表達(dá)明顯高于對(duì)照卵巢組織，且二者呈負(fù)相關(guān)。本研究采用GEPIA在線分析工具分析所得的STAT3、Grim19在卵巢漿液性囊腺癌臨床病例中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果與之一致，進(jìn)一步證實(shí)STAT3、Grim19之間的特異性互作關(guān)系。同時(shí)，本研究檢索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，Grim19在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中特異性低表達(dá)，主要經(jīng)由Grim19/STAT3信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞凋亡、遷移、增殖、侵襲等生物學(xué)過程。

為進(jìn)一步明確STAT3、Grim19的功能，采用Omicshare在線軟件對(duì)篩選出的相關(guān)基因進(jìn)行GO功能注釋富集分析和KEGG通路富集分析，顯示STAT3涉及多種功能如免疫系統(tǒng)過程、生物粘附、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖，且STAT3主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞膜上也表達(dá)，這與其的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相符合。Grim19涉及功能最強(qiáng)的為線粒體ATP合成耦合電子輸運(yùn)，這符合其作為線粒體復(fù)合物Ⅰ輔助亞基的特性。相關(guān)基因的富集分析結(jié)果為深入研究STAT3、Grim19的機(jī)制奠定了一定理論基礎(chǔ)。

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究STAT3、Grim19表達(dá)水平對(duì)臨床病例預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)STAT3表達(dá)水平對(duì)卵巢漿液性囊腺癌的遠(yuǎn)期生存率無(wú)明顯影響，而高表達(dá)Grim19的患者遠(yuǎn)期生存率明顯優(yōu)于低表達(dá)Grim19的患者，提示Grim19對(duì)卵巢癌患者生存的臨床價(jià)值。研究本院上皮性卵巢癌臨床樣本中兩蛋白表達(dá)水平對(duì)卵巢癌預(yù)后的影響發(fā)現(xiàn)，STAT3、Grim19表達(dá)水平與患者遠(yuǎn)期生存率無(wú)明顯相關(guān)，與基于TCGA的研究結(jié)果不一致。分析造成TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析結(jié)果與本課題組研究病例生存分析結(jié)果不一致的原因可能為部分病例資料觀察時(shí)間較短，存在結(jié)尾數(shù)據(jù)較多。

綜上所述，在多種惡性腫瘤中存在STAT3、Grim19特異性表達(dá)，STAT3表達(dá)上調(diào)，Grim19表達(dá)下調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)，且經(jīng)由多種信號(hào)通路影響惡性腫瘤進(jìn)展；Grim19經(jīng)由STAT3調(diào)控卵巢疾病進(jìn)展，有望成為評(píng)價(jià)卵巢癌預(yù)后的指標(biāo)；STAT3在各種生物過程中的重要作用，為卵巢癌靶向治療提供了可能。