余遠(yuǎn)迪，許國(guó)洋，張素輝，鄭 華，付利芝，楊 柳*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460)

【研究意義】羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，為線性雙鏈DNA病毒，基因組大小為134～139 kb，該病毒基因組中間為大的中心編碼區(qū)，參與病毒的組裝和釋放；兩端為反向末端重復(fù)序列[1-2]。臨床上，病毒感染羊后以增生性炎癥為典型特征，表現(xiàn)為在羊的口唇、舌、鼻、乳房等部位開(kāi)始出現(xiàn)紅斑，然后紅斑形成丘疹、囊泡，帶黃色乳脂狀的膿皰外表和結(jié)痂最后變得干燥，并且病毒能反復(fù)感染宿主[3]。近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，羊口瘡在我國(guó)發(fā)生的病例相繼被報(bào)道[4]，當(dāng)人接觸患病的羊或野生動(dòng)物時(shí)容易感染本病，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展和相關(guān)人群的健康構(gòu)成一定威脅?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】羊口瘡病毒的毒力基因、與宿主嗜性相關(guān)的編碼基因及免疫調(diào)節(jié)基因定位于基因組兩側(cè)的末端區(qū)域[5]，該病毒末端部分基因的功能相繼被解析：抑制NF-κB轉(zhuǎn)運(yùn)的ORFV002和ORFV121[6-8]，趨化因子阻遏蛋白ORFV112[9]，GM-CSF/IL-2抑制因子ORF117[10]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白ORFV132[11]，免疫調(diào)節(jié)因子白介素-10 ORFV127[12]，抗細(xì)胞凋亡因子ORFV125[13]，脫氧尿苷三磷酸酶，以及F-box-like錨定蛋白[14]等。已被證實(shí)錨定蛋白重復(fù)序列和F-box結(jié)構(gòu)域蛋白廣泛存在于痘病毒中，大小在400～650個(gè)氨基酸之間[15]，并且病毒在感染宿主的早期表達(dá)F-box-like錨定蛋白[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】重慶是西南地區(qū)養(yǎng)殖羊的主要地區(qū)，在臨床流行病學(xué)調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)羊口瘡持續(xù)在重慶地區(qū)流行，該病已經(jīng)影響重慶地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】進(jìn)一步闡明008基因的特性，為探索008基因的功能和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，本研究對(duì)該基因進(jìn)行克隆，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)和生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

羊口瘡病毒毒株由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所分離保存；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pET-28a(+)、羊口瘡病毒感染羊陽(yáng)性血清由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所保存；925-68047 IRDye?680RD 驢抗山羊 IgG二抗購(gòu)自Li-cor化學(xué)免疫試劑公司；LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基購(gòu)自；氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG、PrimeSTAR GXL DNAPolymerase、pMD 19-T Vector、T4連接酶、NdeI、HindIII、DL 2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表羊口瘡病毒008基因序列，合成一對(duì)引物：OFRV-008-F，5’-CATATGATGCTCTCGCGGGAGTCCGTCGTGATGGATC CGCCGGAAATTAC-3’；OFRV-008-R，5’-AAGCTTTCAGGGGCGGGTCAGCATGGC-3’(斜線部分為NdeI、HindIII酶切位點(diǎn))。

1.2.2 008基因的擴(kuò)增 以分離的羊口瘡病毒DNA為模板擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 90 s；72 ℃ 7 min；16 ℃ 保存，擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物用OMEGA膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2.3 008基因的克隆和重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將純化的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性菌落接種于含Kan(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜，用Omega小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，NdeI、HindIII雙酶切鑒定。測(cè)序正確后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將含有pET-28a(+)-008和pET-28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)工程菌分別轉(zhuǎn)接于含Kan (50 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日按3∶100轉(zhuǎn)接于含Kan(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)至OD600 nm≈1.5，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，分別于誘導(dǎo)后8、16、24 h取菌液10 mL。菌液在4 ℃以10 000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀用5 mL 滅菌水重懸后用超聲粉碎儀在冰上粉碎20 min(工作5 s，間隔5 s，功率300 W)，在4 ℃以10 000 r/min離心10 min。分離上清和沉淀，沉淀用5 mL滅菌水重懸。分別取上清液(含表達(dá)可溶部分)30 μl和重懸液(含表達(dá)非可溶部分，即包涵體)90 μl與上樣緩沖液混合，煮沸變性5 min，瞬時(shí)離心后加入上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 008蛋白的Western blotting分析 將重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印儀進(jìn)行轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)膜儀置于冰上200 mA恒流轉(zhuǎn)膜50 min；用PBST洗滌NC膜，加入含5 %脫脂奶粉的封閉液37 ℃封閉2 h，棄去封閉液，PBST洗滌NC膜5遍，每遍3 min，加入羊口瘡陽(yáng)性血清(1∶100)為一抗；驢抗山羊IgG為二抗(1∶10000)。使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描NC膜觀察。

1.2.6 羊口瘡008蛋白生物信息學(xué)分析 使用ProtScale程序在線分析ORFV 008蛋白的疏水性；使用TMHMM server v.2.0對(duì)008蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；使用SignalP 5.0 server對(duì)ORFV 008蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；使用Protean對(duì)008蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 008基因的擴(kuò)增與克隆

以羊口瘡病毒基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小(1500 bp)一致的片段(圖1)。目的基因經(jīng)過(guò)純化后與pMD19-T載體連接，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-008，經(jīng)酶切得到1500 bp左右的片段，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的基因序列比較同源性達(dá)98.34 %，結(jié)果表明目的基因成功克隆。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.008基因擴(kuò)增片段

2.2 pET-28a(+)-008質(zhì)粒的鑒定

將pET-28a(+)質(zhì)粒與pMD19-T-008質(zhì)粒用NdeI、HindIII雙酶切后連接轉(zhuǎn)化置大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-008，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行PCR以及雙酶切鑒定，得到1 500 bp左右片段(圖2)，測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確，結(jié)果表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-008構(gòu)建成功。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-28a(+)-008質(zhì)粒

2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

取重組誘導(dǎo)菌不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌體分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，試驗(yàn)確定IPTG誘導(dǎo)16 h表達(dá)量最大，表達(dá)產(chǎn)物約為56 kd，與預(yù)期蛋白條帶相符，而未誘導(dǎo)菌和誘導(dǎo)后的空載體均未出現(xiàn)次蛋白條帶(圖3、圖4)。對(duì)超聲裂解細(xì)菌的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，表明重組蛋白以包涵體的形式存在。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1,5,pET-28a(+)空載體分別誘導(dǎo)8、16 h表達(dá)上清產(chǎn)物；2,6.pET-28a(+)空載體分別誘導(dǎo)表達(dá)8、16 h沉淀產(chǎn)物；3,7.pET-28a(+)-008蛋白分別誘導(dǎo)表達(dá)8、16 h上清產(chǎn)物；4.pET-28a(+)-008蛋白分別誘導(dǎo)表達(dá)8、16 h沉淀產(chǎn)物

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1,pET-28a(+)空載體誘導(dǎo)表達(dá)上清產(chǎn)物；2,pET-28a(+)空載體誘導(dǎo)表達(dá)沉淀產(chǎn)物；3.pET-28a(+)-008蛋白誘導(dǎo)表達(dá)上清產(chǎn)物；4.pET-28a(+)-008蛋白誘導(dǎo)表達(dá)沉淀產(chǎn)物

2.4 008蛋白的Western blot鑒定

用羊口瘡陽(yáng)性血清(作為一抗，IRDye驢抗山羊IgG作為二抗)對(duì)未純化的包涵體蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明原核表達(dá)的008重組蛋白能跟羊口瘡陽(yáng)性血清特異性結(jié)合(圖5)，結(jié)果表明008重組蛋白具有良好的抗原性。

2.5 008蛋白生物信息學(xué)分析

使用ProtScale程序基于K-D法在線分析ORFV 008蛋白的疏水性，結(jié)果可知008蛋白大約在C端位置含有一個(gè)典型的疏水性區(qū)域(圖6)，親水性平均系數(shù)(GRAVY)為0.209；使用TMHMM server v.2.0對(duì)008蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，008蛋白1～516位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，氨基酸殘基系數(shù)為1.37，不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP 5.0 server對(duì)ORFV 008蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示008蛋白不具有信號(hào)肽序列(圖7)；使用Protean對(duì)008蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)分析，采用Kyte-Wolf的親水性方案、Karplus-Schulz的柔韌性方案、Emini的表面可及性方案和Jameson-Wolfde 抗原指數(shù)方案綜合預(yù)測(cè)(圖8)，各方案所得到的抗原表位見(jiàn)表1。

表1 單參數(shù)方案預(yù)測(cè)的抗原表位

圖6 ProtScale程序分析008蛋白的疏水性

圖7 SignalP對(duì)008蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖8 008蛋白綜合預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于羊口瘡病毒的致病機(jī)制還了解較少，該病毒的一些基因特性尚未解析。已被證實(shí)錨定蛋白重復(fù)序列和F-box結(jié)構(gòu)域蛋白廣泛存在于痘病毒中，早期的研究表明，F(xiàn)-box-like錨定蛋白利于羊口瘡病毒的復(fù)制[18]，F(xiàn)-box蛋白可通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)多種蛋白質(zhì)的降解，能將底物募集到細(xì)胞SCF(SKP-1、c ullin、F-box)泛素連接酶復(fù)合物上[19-20]；牛痘病毒編碼的ANK/PRANC蛋白CP77是一個(gè)宿主范圍蛋白，與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子p65相互作用，抑制炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[21]；鼠痘病毒編碼的含有4個(gè)F-box-like錨定蛋白和BTB/Kelch蛋白質(zhì)，分別通過(guò)調(diào)節(jié)泛素連接酶活性阻止IκBα的降解，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)[22]；此外，羊口瘡病毒錨蛋白上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)靶基因的表達(dá)從而影響細(xì)胞的缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[23]，羊口瘡病毒的F-box-like/ANK錨定蛋白通過(guò)不同的方式參與病毒致病的途徑，而008蛋白屬于該家族成員，相關(guān)的研究甚少，其在病毒與宿主的互作中發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步挖掘。

通過(guò)SDS-PAGE分析，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)了008蛋白，對(duì)表達(dá)蛋白的抗原性分析結(jié)果表明，重組蛋白具有良好的抗原性。分析ORFV 008蛋白的疏水性，可知008蛋白大約在C端位置含有一個(gè)典型的疏水性區(qū)域，疏水性氨基酸存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部，通過(guò)其疏水的相互作用，在保持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要作用；使用TMHMM server v.2.0對(duì)008蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，008蛋白1～516位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，氨基酸的殘基系數(shù)為1.37，不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，提示它可能在膜受體沒(méi)有起作用；在信號(hào)肽預(yù)測(cè)中，008蛋白前60個(gè)氨基酸中跨膜螺旋中的氨基酸殘疾數(shù)值為0.0002，該蛋白無(wú)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；經(jīng)過(guò)對(duì)親水性指數(shù)、抗原指數(shù)和表面可能性指數(shù)的篩選，排除α螺旋、β折疊內(nèi)不易形成表位的序列，位于β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲處的表位42～47、78～81、129～137、152～156、181～186、228～231、238～244、294～299、339～342、353～357、365～368預(yù)測(cè)區(qū)域較有可能為B細(xì)胞抗原表位，但也不排除其他區(qū)域或者它們的附近也存在B細(xì)胞抗原表位，其他區(qū)域是否存在還需進(jìn)一步的確認(rèn)。

4 結(jié) 論

本研究克隆羊口瘡病毒008基因，并將其插入pET-28a(+)載體中成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，成功表達(dá)008蛋白；并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步探索羊口瘡病毒008蛋白在感染宿主過(guò)程中的機(jī)制和作用奠定基礎(chǔ)，豐富羊口瘡病的致病機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為羊口瘡病毒基因的研究開(kāi)發(fā)提供新的靶標(biāo)。