馬 來(lái)，童桂香，韋信賢，曾德乾，熊建華，王 瑞，黃光華，江林源

(1.北海南方海洋生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，廣西 北海 536000；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；3.南寧市武鳴區(qū)陸斡鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 南寧 530111；4.廣西柳州種畜場(chǎng)，廣西 柳州 545003)

【研究意義】蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)隸屬于腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)腸胞蟲屬(Enterocytozoon)，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲，在2004年最早發(fā)現(xiàn)于泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦，于2009年首次被分離和正式命名報(bào)道，主要感染凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦等重要養(yǎng)殖蝦類，是近年來(lái)危害養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要病原之一[1-3]。EHP可通過水平和垂直傳播，但主要經(jīng)口攝食寄生有EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或水體中的孢子體而感染[4-5]。EHP感染主要導(dǎo)致養(yǎng)殖對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢甚至停滯，表現(xiàn)為對(duì)蝦消瘦、大小不均、重量離散[6]，且患病對(duì)蝦肝胰腺遭到破壞，免疫力降低，極易被其他病原侵染而死亡，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7]。目前，EHP已對(duì)全球?qū)ξr產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，在印度、委內(nèi)瑞拉、中國(guó)、泰國(guó)、越南、馬來(lái)西亞及文萊等國(guó)家均有報(bào)道[8-12]。EHP的危害與其感染數(shù)量密切相關(guān)，輕度感染基本上不影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育，中度感染影響對(duì)蝦的營(yíng)養(yǎng)吸收，嚴(yán)重感染損壞對(duì)蝦免疫系統(tǒng)[13]。因此，建立一種快速且準(zhǔn)確的EHP定量檢測(cè)方法，在蝦苗檢疫、親蝦篩選及成蝦養(yǎng)殖疫情監(jiān)測(cè)過程中根據(jù)其定量數(shù)據(jù)及對(duì)蝦養(yǎng)殖模式制定相應(yīng)措施，對(duì)有效防控由EHP引起的蝦病害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】EHP感染前期無(wú)明顯病癥，需采用組織學(xué)方法或分子生物學(xué)方法等實(shí)驗(yàn)室手段檢測(cè)才能確診。鑒于此，EHP檢測(cè)方法得到快速發(fā)展，現(xiàn)已研發(fā)出多種快速檢測(cè)方法應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)，包括原位雜交、套式PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等[14-17]。這些檢測(cè)方法在靈敏度和便捷程度上各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此如何更快速、高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)EHP仍有待進(jìn)一步研究和探索。相對(duì)于普通PCR，熒光定量PCR的檢測(cè)和分析過程均在密閉的單管里由機(jī)器自動(dòng)完成，具有自動(dòng)化程度高、有效解決PCR產(chǎn)物污染問題及能定量檢測(cè)病原體感染等優(yōu)點(diǎn)[18-19]，被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原的最理想方法；TaqMan-MGB探針是熒光定量PCR使用的一種熒光探針，其3′端淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的MGB結(jié)合物，可實(shí)現(xiàn)高Tm值的探針長(zhǎng)度縮短而有利于提高方法的靈敏度，且探針3′端不發(fā)光的淬滅基團(tuán)與5′端報(bào)告基團(tuán)在空間的位置更接近，使熒光本底降低、檢測(cè)結(jié)果分辨率更高[20-21]，因此TaqMan-MGB探針在人類及動(dòng)植物各種病原體的定量檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[22-26]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，國(guó)內(nèi)尚未發(fā)布EHP檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在蝦肝腸胞蟲病(EHPD)監(jiān)測(cè)計(jì)劃中仍推薦采用套式PCR，但在實(shí)際檢測(cè)工作中，套式PCR存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和不能定量等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足對(duì)EHP進(jìn)行快速定量檢測(cè)的需求。鑒于TaqMan-MGB探針應(yīng)用于熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)，將其應(yīng)用于EHP定量檢測(cè)必將有助于實(shí)現(xiàn)EHPD的快速診斷及有效防控。【擬解決的關(guān)鍵問題】建立一種基于TaqMan-MGB探針的EHP熒光定量PCR檢測(cè)方法，以提高檢測(cè)靈敏度及其效率，為EHP快速定量檢測(cè)及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EHP、蝦虹彩病毒(SIV)、白斑綜合征病毒(WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VpAHPND)、哈維弧菌(Vibrioharveyi)和創(chuàng)傷弧菌(V.vnlnificus)的陽(yáng)性材料均由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；健康無(wú)EHP感染凡納濱對(duì)蝦采自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院SPF凡納濱對(duì)蝦良種場(chǎng)；276份蝦樣品采自廣西北海、欽州、防城港等地養(yǎng)殖場(chǎng)，其中2018和2019年分別收集142和134份。動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker和氨芐青霉素購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體克隆試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀(Mx3005P)為安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 引物及TaqMan-MGB探針設(shè)計(jì)與合成

編碼核糖體小亞基的基因序列區(qū)(SSU rDNA)包含保守區(qū)和高變區(qū)，其中保守區(qū)序列進(jìn)化緩慢且相對(duì)保守，常被用作寄生蟲檢測(cè)的靶基因[27]；葉鍵等[28]研究表明，SSU rDNA基因較孢子壁蛋白基因(SWP)更適合作為檢測(cè)EHP的靶基因。因此，按熒光定量PCR擴(kuò)增引物和TaqMan-MGB探針的設(shè)計(jì)原則，采用Primer Express 3.0在SSU rDNA基因(KF362129)保守區(qū)域設(shè)計(jì)多組特異性擴(kuò)增引物和TaqMan-MGB探針，其中探針5′端標(biāo)記熒光染料FAM、3′端標(biāo)記MGB基團(tuán)，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，驗(yàn)證其特異性后委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。經(jīng)試驗(yàn)初篩，選擇一套效果較好的擴(kuò)增引物及TaqMan-MGB探針(表1)用于EHP熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物及TaqMan-MGB探針信息

1.3 病原DNA提取

取30 mg陽(yáng)性病料組織，按照動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取蝦常見病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈維弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA，最后加60.0 μl洗脫緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以EHP的DNA為模板，滅菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。在20.0 μl反應(yīng)體系中加入2×Probe qPCR Premix ExTaqTM10.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μl，EHP-qF66/EHP-qR66(10 μmol/L)各0.4 μl，EHP-qP66(10 μmol/L)0.4 μl，DNA模板2.0 μl，滅菌水補(bǔ)足至20.0 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；在60 ℃結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。熒光定量PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，制備重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP，并進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。提取重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋至1.0×109～1.0×100拷貝/μl作為標(biāo)準(zhǔn)品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

以3個(gè)梯度(1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，反應(yīng)體系中其他成分濃度不變，將上、下游引物濃度以0.1 μmol/L遞增設(shè)為0.1～0.8 μmol/L，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct)和擴(kuò)增曲線的熒光信號(hào)強(qiáng)度(ΔRn)選擇最佳引物濃度。同時(shí)，以3個(gè)梯度(1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，反應(yīng)體系中其他成分濃度不變，將TaqMan-MGB探針濃度以0.1 μmol/L遞增設(shè)為0.1～0.8 μmol/L，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和ΔRn選擇最佳探針濃度。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及敏感性試驗(yàn)

以10個(gè)梯度(1.0×109～1.0×100拷貝/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，采用優(yōu)化后熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)；利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，建立起始模板拷貝數(shù)(x)對(duì)數(shù)與Ct值(y)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品DNA的擴(kuò)增結(jié)果判斷該方法的定量范圍和敏感性。

1.7 特異性試驗(yàn)

分別以EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈維弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取3個(gè)梯度(1.0×107、1.0×105和1.0×103拷貝/μl)的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，在間隔第7和14天分別進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，記錄各次試驗(yàn)的Ct值，分析組內(nèi)及組間的Ct值變異系數(shù)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性及該方法的重復(fù)性。

1.9 熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

按1.3的方法提取EHP陽(yáng)性病料組織DNA，以10倍梯度稀釋(100～10-5)，取2.0 μl各梯度DNA為模板分別采用優(yōu)化后的熒光定量PCR和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部EHP監(jiān)測(cè)計(jì)劃推薦的套式PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較其敏感性。

1.10 熒光定量PCR和套式PCR檢測(cè)臨床樣品的比較

按1.3的方法提取臨床樣品DNA，分別用熒光定量PCR和套式PCR對(duì)276份臨床蝦樣品(凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和紅螯螯蝦)進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果以檢驗(yàn)熒光定量PCR的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備情況

以EHP的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，可獲得與預(yù)期目的片段大小一致的特異性條帶(圖1)；重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序分析，所得的目的片段序列與GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因?qū)?yīng)部分序列的同源性為100 %，說明目的基因片段正確插入pMD18-T載體，即重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP構(gòu)建成功。取陽(yáng)性克隆菌液提取質(zhì)粒，測(cè)定濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP濃度為6.83×109拷貝/μl，OD260/OD280為1.96，滿足標(biāo)準(zhǔn)品的要求。

M：DL500 DNA Marker；1～3：EHP-SSU rDNA基因；4～5：重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP；NC：陰性對(duì)照

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

分別以1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，上、下游引物濃度為0.1～0.8 μmol/L時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，隨著引物濃度的增大，ΔRn增大、Ct值減小，但引物終濃度在0.6～0.8 μmol/L時(shí)的擴(kuò)增效果(Ct值和ΔRn)差異不明顯。圖2為以1.0×106拷貝/μl標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板的擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，為保證引物的擴(kuò)增效率且不浪費(fèi)試驗(yàn)材料，確定0.6 μmol/L為最佳引物終濃度。

圖2 熒光定量PCR的引物濃度優(yōu)化結(jié)果

分別以1.0×109、1.0×106和1.0×103拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，TaqMan-MGB探針濃度為0.1～0.8 μmol/L時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，隨著探針濃度的增大，ΔRn增大、Ct值減小，但探針終濃度在0.5～0.8 μmol/L時(shí)的擴(kuò)增效果(Ct值和ΔRn)差異不明顯。圖3為以1.0×106拷貝/μl標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板的擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，為保證TaqMan-MGB探針的效率且不浪費(fèi)試驗(yàn)材料，確定0.6 μmol/L為最佳探針濃度。

圖3 熒光定量PCR的TaqMan-MGB探針濃度優(yōu)化結(jié)果

通過引物濃度和探針濃度優(yōu)化后，確定基于TaqMan-MGB探針的熒光定量PCR最佳反應(yīng)體系：2×Probe qPCR Premix ExTaqTM10.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μl，上、下游引物EHP-qF66/EHP-qR66(10 μmol/L)各1.2 μl，TaqMan-MGB探針EHP-qP66(10 μmol/L)1.2 μl，DNA模板2.0 μl，用滅菌水補(bǔ)足至20.0 μl。

2.3 熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及其敏感性

以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品DNA(1.0×109～1.0×100拷貝/μl)為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果(圖4)顯示各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線重復(fù)性好、熒光強(qiáng)度增量明顯，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×109～1.0×103拷貝/μl)的擴(kuò)增曲線呈典型的S形，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×102～1.0×100拷貝/μl)的擴(kuò)增曲線因未達(dá)擴(kuò)增平臺(tái)期而呈半S形，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增曲線。經(jīng)數(shù)據(jù)分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，起始模板拷貝數(shù)為2.0×109～2.0×100拷貝/μl時(shí)，模板濃度對(duì)數(shù)與Ct值間呈良好的線性關(guān)系(圖5)，對(duì)應(yīng)的線性回歸方程為y=-3.232×lg(x)+39.51，Eff.(擴(kuò)增效率)和RSq(相關(guān)系數(shù)方值)分別為103.9 %和1.000。標(biāo)準(zhǔn)品DNA為20拷貝/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)重復(fù)的Ct值分別為34.81、34.88和34.91，仍有明顯的擴(kuò)增曲線，且重復(fù)性好；標(biāo)準(zhǔn)品DNA為2拷貝/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)重復(fù)的Ct值分別為37.84、38.28和38.71，重復(fù)性差。因此，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議在實(shí)際檢測(cè)工作中以Ct值35.00為臨界值，若檢測(cè)樣品的Ct值小于或等于35.00，且有擴(kuò)增曲線，判為EHP陽(yáng)性；Ct值大于35.00，且有擴(kuò)增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為EHP陽(yáng)性；Ct值大于35.00，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為EHP陰性。綜上所述，基于TaqMan-MGB探針建立的EHP熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品具有很高的擴(kuò)增效率，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板為2.0×109～2.0×101拷貝/反應(yīng)時(shí)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增情況，可用于EHP的定量分析，其靈敏度約20拷貝/反應(yīng)。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品DNA的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(1.0×109～1.0×100拷貝/μl)

圖5 熒光定量PCR檢測(cè)EHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR的特異性

采用優(yōu)化后的熒光定量PCR對(duì)蝦常見病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈維弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示只有EHP出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖6)，Ct值分別為22.07、22.10和22.16，判為陽(yáng)性；而其他病原及陰性對(duì)照、空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為陰性。說明基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR對(duì)EHP檢測(cè)具有很強(qiáng)的特異性。

圖6 熒光定量PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5 熒光定量PCR的重復(fù)性

以1.0×107、1.0×105和1.0×103拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品DNA在間隔第7和14天分別進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果(表2)顯示，其組內(nèi)的試驗(yàn)變異系數(shù)(CV)為0.26 %～0.72 %，組間試驗(yàn)變異系數(shù)為0.56 %～0.92 %，表明基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠；同時(shí)說明本研究制備的重組質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，可作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照使用。

表2 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

分別采用基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR和套式PCR對(duì)10倍梯度稀釋的EHP陽(yáng)性DNA (100～10-5)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，熒光定量PCR可檢測(cè)到10-4稀釋度的陽(yáng)性DNA(圖7)，而套式PCR可檢測(cè)到10-3稀釋度的陽(yáng)性DNA(圖8)，即熒光定量PCR的敏感度較套式PCR高一個(gè)數(shù)量級(jí)(10倍)。

圖7 熒光定量PCR的敏感性檢測(cè)結(jié)果

M：DL500 DNA Marker；1～6：套式PCR第一輪PCR產(chǎn)物；7～12：套式PCR第二輪PCR產(chǎn)物；NC：陰性對(duì)照

2.7 熒光定量PCR和套式PCR檢測(cè)臨床樣品的結(jié)果比較

分別采用基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR和套式PCR對(duì)276份臨床蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(表3)顯示，有46份蝦樣品用兩種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，Ct值為15.73～32.91，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.232×lg(x)+ 39.51計(jì)算，其EHP拷貝數(shù)在1.10×102～2.28×107拷貝/反應(yīng)，蝦樣品的EHP含量為1.10×102～2.28×107拷貝/mg；有8份蝦樣品經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性而經(jīng)套式PCR檢測(cè)呈陰性，Ct值為33.16～36.49，其EHP拷貝數(shù)在9.2×101～8.6×100拷貝/反應(yīng)，蝦樣品的EHP含量為9.2×101～8.6×100拷貝/mg；有221份蝦樣品用兩種方法檢測(cè)均為陰性，即兩種方法的符合率為96.7 %。說明在實(shí)際檢測(cè)工作中采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，可提高EHP低拷貝數(shù)樣品的檢出率，其檢測(cè)靈敏度約10拷貝/mg。2018和2019年廣西蝦樣品的EHP陽(yáng)性率分別為16.2 %(23/142)和30.6 %(41/134)，主要檢出品種為凡納濱對(duì)蝦。

表3 采用熒光定量PCR和套式PCR檢測(cè)臨床樣品EHP結(jié)果比較

3 討 論

我國(guó)于2013年首次證實(shí)在養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦中存在EHP感染，并于2017年將EHPD納入國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃。近年來(lái)的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，EHP陽(yáng)性率一直占據(jù)對(duì)蝦疫病之首，EHP感染已蔓延至我國(guó)所有對(duì)蝦養(yǎng)殖地區(qū)，包括廣東、廣西、海南、福建、山東、江蘇、浙江、天津等沿海地區(qū)及新疆等內(nèi)陸地區(qū)，感染品種包括凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、克氏原螯蝦和青蝦等我國(guó)主要養(yǎng)殖蝦類品種，說明EHPD在我國(guó)的流行傳播形勢(shì)十分嚴(yán)峻，已成為制約我國(guó)當(dāng)前蝦類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要疫病[29]。EHP感染的苗種和養(yǎng)殖對(duì)蝦是EHPD傳播的重要風(fēng)險(xiǎn)源。因此，為避免該病原的傳播擴(kuò)散和發(fā)生發(fā)展，亟需研發(fā)出一種方便快捷的檢測(cè)方法。目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和國(guó)內(nèi)均未發(fā)布EHP檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在EHPD監(jiān)測(cè)計(jì)劃中推薦采用套式PCR進(jìn)行檢測(cè)，但在實(shí)際檢測(cè)工作中套式PCR需兩輪PCR及電泳，操作繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且不可定量；此外，EHP感染數(shù)量與其危害密切相關(guān)的特點(diǎn)需對(duì)EHP進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)，才能根據(jù)EHP定量數(shù)據(jù)制定相應(yīng)的預(yù)防或預(yù)后措施，套式PCR顯然已無(wú)法滿足對(duì)EHP進(jìn)行快速定量檢測(cè)的要求?；赥aqMan-MGB探針的熒光定量PCR既能克服套式PCR的上述缺點(diǎn)，又能發(fā)揮熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)，尤其是TaqMan-MGB探針連接的MGB淬滅基團(tuán)具有探針長(zhǎng)度短、熒光本底小、穩(wěn)定性好及分辨率高等特點(diǎn)，非常適用于病原體的定量檢測(cè)[30]。

本研究鑒于EHP定量檢測(cè)的需求及TaqMan-MGB探針應(yīng)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，在EHP的SSU rDNA基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan-MGB探針，制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18-T-SSUEHP，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化以確定檢測(cè)EHP的熒光定量PCR最佳條件，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pMD18-T-SSUEHP的DNA穩(wěn)定性好，其濃度和純度均能滿足作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照的要求；建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率高，起始模板范圍在2×101～2×109拷貝/反應(yīng)時(shí)，其擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，能準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增情況；靈敏度高，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)靈敏度可達(dá)20拷貝/反應(yīng)，對(duì)蝦樣品的EHP檢測(cè)靈敏度約10拷貝/mg，較套式PCR約提高10倍；特異性強(qiáng)，對(duì)蝦類其他常見病原均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)；重復(fù)性好，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1.00 %；此外，擴(kuò)增和產(chǎn)物分析同步完成，無(wú)需PCR后處理，整個(gè)檢測(cè)過程可在1 h內(nèi)完成。采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與套式PCR同時(shí)對(duì)276份臨床蝦樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)于EHP拷貝數(shù)低(小于100拷貝/mg)的樣品，TaqMan-MGB探針熒光定量PCR比套式PCR具有更高的靈敏度，總陽(yáng)性檢出率提高2.6 %(多檢出7份)。可見，基于TaqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量范圍寬及簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，不僅能滿足臨床上對(duì)EHP進(jìn)行快速定量檢測(cè)的需求，還能提高EHP低感染水平如早期感染或潛伏感染的陽(yáng)性檢出率，對(duì)控制EHPD的傳播與擴(kuò)散具有重要意義。

本研究對(duì)近年廣西養(yǎng)殖蝦類樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，2019年EHP陽(yáng)性檢出率(30.6 %)較2018年(16.2 %)約增加一倍，且養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和紅螯螯蝦均有檢測(cè)到EHP陽(yáng)性，在臨床上表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢或停滯的蝦幾乎都能檢測(cè)到EHP，說明EHPD已成為危害廣西養(yǎng)殖對(duì)蝦主要疫病之一。但由于EHP感染不直接導(dǎo)致蝦類死亡而易被忽視，且EHP感染數(shù)量與其危害呈正相關(guān)，因此加強(qiáng)蝦類養(yǎng)殖過程中EHP感染強(qiáng)度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可為制定相應(yīng)的防控措施提供重要依據(jù)?；赥aqMan-MGB探針建立的熒光定量PCR符合當(dāng)前養(yǎng)殖生產(chǎn)中對(duì)EHP高靈敏定量檢測(cè)技術(shù)的需求，將在親蝦篩選、苗種檢疫、疫情監(jiān)測(cè)等各養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

基于TaqMan-MGB探針建立的EHP熒光定量PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量范圍寬及簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于蝦類樣品的EHP定量檢測(cè)，可為EHP實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及EHPD快速診斷提供一種新的技術(shù)手段。