符慧娟，李星月，李其勇，朱從樺，向運(yùn)佳，張 鴻

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

【研究意義】油菜是我國重要的油料作物之一[1]。四川作為我國油菜的主產(chǎn)區(qū)和優(yōu)勢區(qū)，隨著長江中下游地區(qū)油菜播種面積的減少，四川油菜種植優(yōu)勢更加凸顯。近年來，為追求高產(chǎn)量和高收益，農(nóng)民在種植過程中盲目過量的施加肥料，造成土壤酸化嚴(yán)重、土傳病害加劇，因此，既要保證油菜免遭嚴(yán)重病蟲害，還要穩(wěn)定油菜原有的品質(zhì)和產(chǎn)量顯得尤為重要。光合細(xì)菌(Photosyntheticbacteria，PSB)屬于原核生物界薄壁菌門中的厭氧光合菌綱，它大量存在于自然水域的厭氧層上部，是一類以光能和低級(jí)有機(jī)物作為能源來源進(jìn)行不放氧光合作用的微生物，它可以產(chǎn)生促進(jìn)生長因子進(jìn)而提高土壤肥力，加強(qiáng)植物光合作用，并且光合細(xì)菌菌體內(nèi)含有多種維生素、豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸、輔酶Q10等多種生理活性物質(zhì)，無毒、安全[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)前，光合細(xì)菌的研究主要集中在有機(jī)廢水的處理、動(dòng)物飼養(yǎng)領(lǐng)域、光合細(xì)菌制氫及光合細(xì)菌生產(chǎn)高性價(jià)比有機(jī)物四方面[4-7]。除此之外，光合細(xì)菌對(duì)土壤的生物固氮能力有巨大的作用，它與其他固氮菌的共存可大大提高土壤肥力，作為底肥及葉面肥時(shí)可改善土壤板結(jié)、鹽化等問題，幫助植物根系發(fā)育[8]。在植物抗性和農(nóng)藥殘留、病毒等各種病原物產(chǎn)生有效抗性，可在一定程度上起到植物抗病害作用，另外，它還可以通過氧化或降解殘留在土壤中的農(nóng)藥、硫化氫及胺類等有毒化合物，減少有害物質(zhì)在土壤中的沉淀累積，對(duì)土壤起一定解毒作用，避免或降低農(nóng)作物中有害物質(zhì)的積累，保證農(nóng)副產(chǎn)品的安全[9-10]。硅肥是一種新型肥料，它能夠?yàn)橹参锾峁┢湫枰挠幸嬖兀瑢?duì)油菜的農(nóng)藝性狀等也存在較大的影響，能顯著提高油菜產(chǎn)量和理論產(chǎn)油量[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近些年來，領(lǐng)域內(nèi)各學(xué)者對(duì)光合細(xì)菌持續(xù)保持著一定研究熱度，而針對(duì)硅肥與光合細(xì)菌分別及混合施用對(duì)作物產(chǎn)量等影響的效果對(duì)比研究較少，本研究設(shè)置硅肥和光合細(xì)菌組合施用，通過比較分析硅肥和光合細(xì)菌對(duì)油菜的土壤養(yǎng)分、土壤酶活性、油菜植株性狀和油菜根腫病發(fā)病率的影響，運(yùn)用Illumina高通量測序技術(shù)研究光合細(xì)菌處理下油菜根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，探討光合細(xì)菌對(duì)油菜根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為改善油菜土壤環(huán)境、提高油菜品質(zhì)與產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

供試油菜品種為四川的油菜主栽品種川油36號(hào)。供試光合細(xì)菌為紅假單胞菌屬Rhodopseudomonasspp.，濃度為≥30億cfu/mL；供試硅肥為邁樂土壤調(diào)理劑(SiO2≥ 20 %)，由山西邁樂肥業(yè)有限責(zé)任公司提供。試驗(yàn)地前作夏玉米，肥力中等，土壤類型為紫色土，土壤有機(jī)質(zhì)含量為1.63 %，堿解氮為25.44 mg·kg-1，有效磷為6.78 mg·kg-1，速效鉀為86.64 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017-2018年在四川省廣漢市進(jìn)行，采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理和一個(gè)空白對(duì)照處理，其中，GB為施用240 L·hm-2光合細(xì)菌處理，Si為施用600 kg·hm-2硅肥處理，GB+Si為施用240 L·hm-2光合細(xì)菌、600 kg·hm-2硅肥的混合處理，CK為未施用硅肥和光合細(xì)菌的空白對(duì)照處理，底肥采用15∶15∶15的氮磷鉀復(fù)合肥一次性施用，平均施用量為750 kg·hm-2。

播種期9月29日，采用直播方式，試驗(yàn)密度為12萬株·hm-2，每小區(qū)24 m2(4 m×6 m)，小區(qū)間隔0.5 m，撬窩點(diǎn)播，行距20 cm，窩距20 cm。試驗(yàn)區(qū)四周設(shè)寬1 m走道，走道外圍設(shè)有保護(hù)行。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分測定 油菜播種未施用底肥前，采用五點(diǎn)取樣法對(duì)試驗(yàn)田耕作層進(jìn)行取樣，測定全氮、堿解氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量。全氮用微量凱氏定氮法；有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法；堿解氮用堿解擴(kuò)散法；銨態(tài)氮用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法；硝態(tài)氮用酚二磺酸比色法；有效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀用1 mol·L-1NH4OAc浸提-火焰光度法。

于油菜成熟期，采用五點(diǎn)取樣法對(duì)試驗(yàn)區(qū)耕作層進(jìn)行取樣，測定土壤pH值、土壤有機(jī)質(zhì)和土壤堿解氮，土壤pH值用PHS-29A型酸度計(jì)(上海第二儀器廠生產(chǎn))測定，水∶土=2.5∶1。

1.3.2 土壤酶活測定 采用高錳酸鉀滴定法測定土壤過氧化氫酶活性、3,5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性、利用靛酚藍(lán)比色法測定脲酶水解尿素產(chǎn)生的NH3-N含量確定土壤脲酶活性、酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定、3,5-二硝基水楊酸比色法測定纖維素酶。

1.3.3 植物指標(biāo)測定 經(jīng)濟(jì)性狀及產(chǎn)量：到成熟期時(shí)，每小區(qū)取5株樣進(jìn)行室內(nèi)考種，考察項(xiàng)目包括有效分枝高度、株高、莖粗、有效分枝數(shù)、單株有效角果數(shù)、30角果粒數(shù)、千粒重、種子水分；每小區(qū)單打單收曬種測定實(shí)際籽粒產(chǎn)量。

1.3.4 土壤總DNA 的提取及16S rRNA基因的PCR 擴(kuò)增土壤總DNA 基因組采用DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取。真菌菌群用ITS(Internal transcribed spacer)序列高通量測定，遵循Illumina測序儀文庫構(gòu)建方法，以ITS3-4 為目標(biāo)DNA區(qū)域，采用擴(kuò)增引物為：ITS1：(5′-TCC GTT GGT GAA CCA GCG G-3′)，ITS4: (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。真菌PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠(AgencourtAMPure XP)處理，真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段小于400 bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度為20 pmol。將樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司在IlluminaMiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理及相關(guān)分析采用Excel 2007 軟件進(jìn)行，相關(guān)性分析采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤pH值、堿解氮、有機(jī)質(zhì)含量在光合細(xì)菌和硅肥互作下的表現(xiàn)

由圖1可以看出，通過對(duì)成熟期油菜土壤pH、土壤堿解氮和土壤有機(jī)質(zhì)含量的測定發(fā)現(xiàn)，3種處理對(duì)油菜土壤pH值均無顯著影響，Si、GB+Si 2種處理僅能夠略微提高油菜根系土壤pH，但與對(duì)照相比沒有顯著差異；Si處理能夠顯著提高土壤堿解氮含量，而GB和GB+Si處理對(duì)土壤堿解氮含量無顯著影響；GB和GB+Si處理顯著增加土壤有機(jī)質(zhì)含量。

CK：空白對(duì)照；GB：光合細(xì)菌240 L·hm-2；Si：硅肥600 kg·hm-2；GB+Si：光合細(xì)菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.2 土壤酶活力在光合細(xì)菌和硅肥互作下的表現(xiàn)

如圖2所示，通過對(duì)成熟期油菜的土壤過氧化氫酶(S-CAT)、土壤蔗糖酶(S-SC)、土壤脲酶(S-UE)、土壤酸性磷酸酶(S-ACP)和土壤纖維素酶(S-CL)的測定發(fā)現(xiàn)，各處理下的土壤酶活性差異明顯。GB、GB+Si處理對(duì)S-CAT活力有較優(yōu)增益效果；S-SC和S-UE在GB+Si處理時(shí)活力得到了明顯升高，其中S-UE的活力值范圍趨近于760μg/d/g；S-ACP活力在GB和Si處理時(shí)有明顯提升，其中GB處理的影響更為顯著；Si單獨(dú)處理下，S-CL活力顯著提升，其余處理對(duì)S-CL活力的影響不顯著。

CK：空白對(duì)照，GB：光合細(xì)菌240 L·hm-2，Si：硅肥600 kg·hm-2，GB+Si：光合細(xì)菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.3 油菜根腫病發(fā)生率在光合細(xì)菌和硅肥互作下的表現(xiàn)

各個(gè)處理的油菜根腫病發(fā)病率有顯著差異(圖3)，與對(duì)照相比，光合細(xì)菌單獨(dú)施用或同硅肥混合施用，都能有效降低油菜的根腫病發(fā)病率，而硅肥單獨(dú)使用，并沒有抑制根腫病發(fā)病率的作用。光合細(xì)菌有抑制根腫病病原菌侵染油菜根系的作用，而硅肥本身不能起到降低根腫病發(fā)病率的效果，只能說輔助改善油菜的根際土壤環(huán)境，提高植株的生理抗性。

CK：空白對(duì)照，GB：光合細(xì)菌240 L·hm-2，Si：硅肥600 kg·hm-2，GB+Si：光合細(xì)菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.4 油菜產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)性狀在光合細(xì)菌和硅肥互作下的表現(xiàn)

本試驗(yàn)共4個(gè)處理，分別測定了試驗(yàn)區(qū)油菜的有效分枝高度、株高、莖粗、有效分枝數(shù)(一次)、有效分枝數(shù)(二次)、單株有效角果數(shù)、30角果粒數(shù)、千粒重、種子水分、小區(qū)產(chǎn)量十項(xiàng)指標(biāo)，如表1所示，油菜有效分枝高度、株高、莖粗等指標(biāo)在各個(gè)處理的影響均不顯著。在GB處理時(shí)，油菜植株單株有效角果數(shù)、小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量兩項(xiàng)指標(biāo)明顯高于空白對(duì)照及其他處理；Si處理下油菜植株株高、有效分枝數(shù)(二次)兩項(xiàng)指標(biāo)明顯高于空白對(duì)照處理及其余處理，但小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量優(yōu)勢不突出；GB+Si處理下油菜植株30角果粒數(shù)、千粒重等指標(biāo)相較于空白對(duì)照處理有明顯優(yōu)勢，小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量略高于CK對(duì)照處理。

表1 不同處理對(duì)油菜植株各指標(biāo)的影響

2.5 光合細(xì)菌對(duì)油菜根際細(xì)菌群落在屬分類水平的影響

光合細(xì)菌的施入對(duì)油菜根際細(xì)菌群落在屬的分類水平上有顯著的影響(表2和圖4)，光合細(xì)菌提高了固氮菌-芽單胞菌屬Gemmatimonas、植物根際促生菌-假單胞菌屬Pseudomona的種群數(shù)量和比例，對(duì)油菜根際微生態(tài)環(huán)境有明顯的改良作用，不僅有利于根系的健康生長，并能利用生防菌優(yōu)勢抑制土壤中的植物病原菌，減少油菜的土傳病害發(fā)病率。

CK為空白對(duì)照，GB為光合細(xì)菌處理240 L·hm-2

表2 光合細(xì)菌對(duì)油菜根際細(xì)菌群落在屬分類水平的影響

3 討 論

3.1 光合細(xì)菌和硅肥對(duì)油菜土壤肥力和酶活力的影響

光合細(xì)菌可以提高土壤肥力，降低土壤酸堿度[12]。本研究結(jié)果顯示，光合細(xì)菌處理下有機(jī)質(zhì)含量得到顯著提高，堿解氮含量有微小的提升，但土壤pH降低；硅肥處理下，pH、有機(jī)質(zhì)含量得到提高，堿解氮含量顯著升高；光合細(xì)菌和硅肥分別顯著提高了有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量，將其混合施用后，pH、堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量均得到提升，土壤肥力呈現(xiàn)了更綜合和全面的提升，說明光合細(xì)菌和硅肥搭配使用能夠有效促進(jìn)相互之間作用的發(fā)揮。光合細(xì)菌還能產(chǎn)生很多有價(jià)值的有機(jī)物，如單細(xì)胞蛋白、類胡蘿卜素等[4]。同時(shí)，施用適量的光合菌肥數(shù)量可以較好的促進(jìn)酶活，促進(jìn)植物生長。有研究表明，復(fù)合菌劑處理促進(jìn)了過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶、纖維素酶的活性得到升高[13]。本研究結(jié)果得出，S-CAT、S-SC、S-UE、S-ACP 4種酶活力在施用光合細(xì)菌后都有提升，其中S-CAT、S-ACP的酶活力呈現(xiàn)顯著增加；S-CAT、S-SC、S-UE、S-ACP、S-CL的酶活力在硅肥處理下均有所提高，但僅對(duì)S-CL的酶活力影響達(dá)到了顯著水平；光合細(xì)菌和硅肥混合施用處理下，S-CAT、S-SC、S-UE的酶活力比分別單獨(dú)施用光合細(xì)菌和硅肥的提升效果更佳，但在對(duì)S-ACP和S-CL的活力影響為負(fù)。

3.2 光合細(xì)菌和硅肥對(duì)油菜產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)性狀的影響

有研究顯示，通過光合菌劑沾根或噴施處理，能夠促進(jìn)水稻生長發(fā)育、促進(jìn)水稻灌漿、增加稻米蛋白質(zhì)含量、提升水稻品質(zhì)[14]。在同基礎(chǔ)之下，采用光合細(xì)菌噴施之后顯著提高了蔬菜的產(chǎn)量[15]。本文通過研究光合細(xì)菌和硅肥耦合作用下對(duì)油菜產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)性狀的影響，結(jié)果顯示，GB、Si、GB+Si處理下油菜千粒重和小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量相較于空白對(duì)照處理有顯著優(yōu)勢，種子水分含量小于CK處理，千粒重、種子水分、小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量對(duì)油菜產(chǎn)油量存在影響，千粒重、小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量與油菜產(chǎn)油量正相關(guān)，種子水分與油菜產(chǎn)油量負(fù)相關(guān)，因此GB處理下，油菜千粒重、種子水分、小區(qū)實(shí)測產(chǎn)量相較于其余處理呈顯著提高水平，油菜的產(chǎn)量及產(chǎn)油量都具有明顯優(yōu)勢。

3.3 光合細(xì)菌和硅肥對(duì)油菜根腫病發(fā)生率的影響

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[16]，光合細(xì)菌具有明顯抑制真菌增殖的作用，它通過提高放線菌數(shù)量抑制真菌增殖，改善土壤環(huán)境，使根系活力增強(qiáng)促進(jìn)其對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，減少土傳病害的發(fā)生。有研究表明，PSB發(fā)酵液中含有多種生理活性物質(zhì)和微生物菌群，這些生理活性物質(zhì)能夠激活植物細(xì)胞的活性，提高細(xì)胞的光合作用能力，微生物菌群可代謝生成多種酶和有機(jī)酸，促進(jìn)土壤中有益菌的增加及各養(yǎng)分分解、改善土壤結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)[17-19]。本研究結(jié)果顯示，光合細(xì)菌單獨(dú)或混合施用情況下，均能夠降顯著低油菜根腫病發(fā)病率，推測其原因：光合細(xì)菌通過提高有益菌的數(shù)量，調(diào)節(jié)土壤環(huán)境，有效改善油菜根際土壤菌群結(jié)構(gòu)，降低油菜根腫病的發(fā)生幾率。

4 結(jié) 論

光合細(xì)菌和硅肥均對(duì)土壤養(yǎng)分、土壤酶活性及油菜的產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)性狀等都產(chǎn)生了有益的影響，并有效減低了油菜根腫病的發(fā)病率，對(duì)油菜產(chǎn)量、產(chǎn)油量和根腫病抑制效果的影響由高到低排序?yàn)椋汗夂霞?xì)菌>光合細(xì)菌+硅肥>硅肥>空白對(duì)照。從土壤微生態(tài)角度出發(fā)，光合細(xì)菌促進(jìn)了有益菌的生存和繁殖，提高了固氮菌、植物根際促生菌的數(shù)量，改善了油菜根際微生態(tài)環(huán)境、優(yōu)化了根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)結(jié)果表明光合細(xì)菌與硅肥在增強(qiáng)油菜土壤肥力、抑制油菜土傳病害方面具有潛力，可以在油菜健身栽培與綠色生產(chǎn)中的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。