閃 瑤，廖旺姣，鄒東霞，吳耀軍，黃華艷，黃乃秀

(1.廣西國(guó)有高峰林場(chǎng)，廣西 南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002)

【研究意義】降香黃檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)俗稱(chēng)海南黃花梨，是目前廣西大力推廣種植的珍貴樹(shù)種，其心材是名貴家具和工藝品的優(yōu)質(zhì)材料，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。但大面積營(yíng)造純林后病蟲(chóng)發(fā)生為害較普遍，其中炭疽病危害會(huì)引起降香黃檀嚴(yán)重落葉，影響樹(shù)木正常生長(zhǎng)[1-4]。蜘蛛蘭炭疽菌(Colletotrichumhymenocallidis)是降香黃檀炭疽病的一種新病原菌，目前對(duì)其生物學(xué)特性了解甚少。因此，分析降香黃檀炭疽病蜘蛛蘭炭疽菌的生物學(xué)特性，對(duì)監(jiān)控由該菌引起的炭疽病發(fā)生流行動(dòng)態(tài)和制定有效的防控策略具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】伍慧雄等[2]、梁遠(yuǎn)楠[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，炭疽病是危害廣東肇慶市降香黃檀的主要病害。董文統(tǒng)等[4]調(diào)查顯示，炭疽病是危害降香黃檀的主要病害。關(guān)于病原菌，桑利偉等[5]、董文統(tǒng)[6]研究表明，膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.]是海南省降香黃檀炭疽病的病原菌。吳奉奇[7]研究認(rèn)為，暹羅刺盤(pán)孢(Colletotrichumsiamense)是廣東肇慶市降香黃檀炭疽病病原菌。在病害防治方面，董文統(tǒng)[6]開(kāi)展海南省降香黃檀炭疽病的生物學(xué)特性和病害流行規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)丙環(huán)唑、氟硅唑和吡唑醚菌酯?代森3種藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定效果較好；章穎等[8]通過(guò)室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)溴菌腈、吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑?qū)迪泓S檀炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果較佳；陳彧等[9]從降香黃檀葉片中分離篩選出對(duì)炭疽病抑菌率較高的拮抗細(xì)菌Y23；周潔塵等[10]從13種海南省外來(lái)入侵植物中篩選出垂序商陸和勝紅薊2種對(duì)降香黃檀炭疽病菌起良好抑菌作用的植物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有研究表明，炭疽病的病原菌在降香黃檀不同栽培生境存在差異[5-7]，本研究在廣西獲得的降香黃檀炭疽病病原菌與海南省和廣東省不同，但針對(duì)其生物學(xué)特性的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析影響降香黃檀炭疽病蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的溫度、pH、碳氮源和光照等因子，為降香黃檀炭疽病的監(jiān)測(cè)及防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

采集廣西崇左市林業(yè)科學(xué)研究所降香黃檀苗圃感染炭疽病的降香黃檀葉片，按常規(guī)組織分離獲得純培養(yǎng)，經(jīng)單孢純化，依據(jù)柯赫氏法則測(cè)定其致病性，參考廖旺姣等的方法[11]采用形態(tài)特征和分子系統(tǒng)學(xué)鑒定后，保存至PCA斜面培養(yǎng)基，選擇性狀優(yōu)良的HC01菌株作為供試菌株，移入PDA培養(yǎng)基[12]平板上培養(yǎng)(25 ℃) 6 d后供測(cè)試用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響 將HC01菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，以內(nèi)徑為6 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到PDA平板中間，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃溫度條件下暗培養(yǎng)，各溫度處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種6 d后以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，于接種15 d后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算產(chǎn)孢量[13-14]。挑取蜘蛛蘭炭疽菌的分生孢子，將用PDB培養(yǎng)液[12]配制的孢子懸浮液(2.00×106個(gè)/mL)滴在凹面玻片上，分別置于上述9個(gè)溫度下保濕培養(yǎng)，6 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每處理6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)檢查100個(gè)孢子。

1.2.2 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響 參考廖旺姣等[14]的小容器空氣濕度調(diào)節(jié)法，將分生孢子液(濃度同1.2.1)涂抹于載玻片上，陰干后置于50 %～100 %范圍內(nèi)的7種不同濕度干燥器中，每處理3個(gè)重復(fù)，室溫(25 ℃)下保濕6 h后鏡檢其孢子萌發(fā)率。

1.2.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 配制PDB培養(yǎng)液，用1 mol/L HCl和NaOH將其調(diào)配為pH 2～12(間隔為1)的培養(yǎng)液，分別接入3塊直徑為6 mm的菌餅，3個(gè)重復(fù)，28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)，10 d后過(guò)濾收集菌絲，80 ℃烘干至恒重后，稱(chēng)量菌絲干重。

1.2.4 碳和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 參考方中達(dá)[12]的方法，以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量的D-果糖等9種碳源置換蔗糖，配制成含不同碳源的培養(yǎng)基；用等質(zhì)量的尿素等9種氮源置換硝酸鈉，配制成含不同氮源的培養(yǎng)基。挑取直徑為6 mm的菌餅接種至上述不同碳、氮源培養(yǎng)基平板中央，每處理3個(gè)重復(fù)，置于25 ℃恒溫下暗培養(yǎng)6 d后，按1.2.1方法測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.5 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 設(shè)完全黑暗、連續(xù)光照、12 h光暗交替(8 W，燈皿距離20 cm) 3個(gè)光照條件，參考廖旺姣等[13]的方法，挑取直徑6 mm的菌餅接種于PDA平板中央，置于上述光照條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后按1.2.1方法測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 13.01進(jìn)行整理，以Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，蜘蛛蘭炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)溫度范圍為10～35 ℃，溫度過(guò)低(5 ℃)或過(guò)高(40 ℃)菌絲不生長(zhǎng)，28和30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，其次是25和35 ℃。方差分析結(jié)果顯示，30 ℃處理蜘蛛蘭炭疽菌的菌落直徑最大，其次為28 ℃處理，二者間無(wú)顯著差異(P>0.05，下同)，但均顯著大于其他溫度處理的菌落直徑(P<0.05，下同)，說(shuō)明28～30 ℃較適蜘蛛蘭炭疽菌生長(zhǎng)；蜘蛛蘭炭疽菌在10～35 ℃均能產(chǎn)生分生孢子，其中在28 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，25 ℃次之，二者間差異不顯著，但均顯著大于其他溫度處理，說(shuō)明25～28 ℃為較適宜蜘蛛蘭炭疽菌產(chǎn)孢的溫度；分生孢子在15～30 ℃均能萌發(fā)，其中在20～30 ℃萌發(fā)率均在89.33 %以上，而在28 ℃時(shí)萌發(fā)率最高，30 ℃時(shí)次之，二者間差異不顯著，但均顯著高于除25 ℃處理外的其他溫度處理，說(shuō)明28～30 ℃為較適宜蜘蛛蘭炭疽菌萌發(fā)的溫度。綜上所述，最適合蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的溫度為28 ℃。

表1 不同溫度對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

2.2 濕度對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，蜘蛛蘭炭疽菌分生孢子在相對(duì)濕度100 %+水滴、相對(duì)濕度100 %和90 % 3個(gè)條件下可以萌發(fā)，在相對(duì)濕度50 %～85 %條件下不萌發(fā)。其中，以100 %+水滴條件下萌發(fā)效果最佳，保濕6 h的萌發(fā)率達(dá)93.00 %，在100 %濕度下的萌發(fā)率次之，保濕6 h的萌發(fā)率為79.83 %，在相對(duì)濕度為90 %時(shí)萌發(fā)率銳減，保濕6 h的萌發(fā)率僅0.67 %，且三者間差異顯著。

表2 不同濕度對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌分生孢子萌發(fā)的影響

2.3 pH對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖1可看出，蜘蛛蘭炭疽菌菌絲在pH 3～12范圍均能生長(zhǎng)，其中最適生長(zhǎng)的pH為5，在強(qiáng)酸性條件下(如pH為2時(shí))菌絲不生長(zhǎng)，pH大于6菌絲生長(zhǎng)量逐漸減少，尤其是pH為12的強(qiáng)堿性條件下，菌絲生長(zhǎng)量極少；差異顯著性分析結(jié)果表明，不同pH處理菌絲的生長(zhǎng)量差異顯著。說(shuō)明蜘蛛蘭炭疽菌在弱酸性條件下生長(zhǎng)較好。

曲線上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 碳源對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

從圖2可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在供試的10種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中在D-果糖、蔗糖、D-木糖、甘露醇、D-山梨醇和可溶性淀粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，在25 ℃下培養(yǎng)6 d時(shí)的菌落直徑分別為86.16、85.63、85.31、84.97、84.53和84.30 mm，相互間差異不顯著，但均顯著大于其他碳源培養(yǎng)基處理；在葡萄糖碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑也較大，為81.84 mm，顯著大于在阿拉伯樹(shù)膠粉、乳糖和D-麥芽糖3種碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑；在D-麥芽糖碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，菌落直徑僅為44.53 mm，顯著低于其他碳源培養(yǎng)基。從圖2還可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在蔗糖碳源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最多，為1.50×106個(gè)/mL，在D-麥芽糖碳源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最少，為0.83×106個(gè)/mL，在其余碳源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量為1.00×106～1.33×106個(gè)/mL，但相互間差異不顯著。

不同菌落直徑和產(chǎn)孢量圖柱上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.5 氮源對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

從圖3可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在多種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中在有機(jī)氮源酵母粉、牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，25 ℃培養(yǎng)6 d時(shí)菌落直徑分別為84.81、83.54和82.23 mm，處理間差異不顯著；在硫酸銨培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落直徑僅24.97 mm，顯著小于其他氮源培養(yǎng)基的菌落直徑。從圖3還可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在牛肉膏氮源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大，達(dá)3.50×106個(gè)/mL，其次是硫酸銨培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量達(dá)3.00×106個(gè)/mL，二者間差異不顯著，但均明顯大于其他氮源培養(yǎng)基，而在硝酸鈉和甘氨酸培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最小，均為1.00×106個(gè)/ mL?？梢?jiàn)，酵母粉和牛肉膏是更適合蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的氮源。

2.6 光照對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

由表3可知，蜘蛛蘭炭疽菌在完全黑暗、連續(xù)光照和12 h光暗交替處理中的菌落直徑分別為80.91、88.12和84.04 mm，相互間差異顯著，說(shuō)明充足的光照能加速蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)；3種光照處理的產(chǎn)孢量分別為1.50×106、3.33×106和2.83×106個(gè)/mL，即連續(xù)光照處理的產(chǎn)孢量最大，12 h光暗交替處理次之，完全黑暗處理最小，且相互間差異顯著，說(shuō)明充足的光照可促進(jìn)蜘蛛蘭炭疽菌產(chǎn)生分生孢子。

表3 不同光照對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

3 討 論

本研究結(jié)果表明，蜘蛛蘭炭疽菌在10～35 ℃均能生長(zhǎng)，當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)減緩，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率急劇減少，當(dāng)溫度達(dá)40 ℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)，而溫度為28～30 ℃時(shí)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均較高，其中最適合蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的溫度為28 ℃，與董文統(tǒng)[6]報(bào)道海南降香黃檀炭疽病菌膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和鄭肖蘭等[15]報(bào)道瓊中綠橙炭疽病菌(C.gloeosporioides)最適生長(zhǎng)溫度均為28 ℃的結(jié)果一致；分生孢子在飽和濕度且有水滴條件下萌發(fā)效果最佳，與廖旺姣等[14]研究發(fā)現(xiàn)降香黃檀苗圃或林間在4月溫濕度較低時(shí)開(kāi)始發(fā)病，在5-8月溫濕度較高時(shí)病害迅速擴(kuò)展至高峰期，9-10月連續(xù)晴天持續(xù)高溫病斑擴(kuò)展緩慢或不擴(kuò)展的實(shí)際情況相吻合。說(shuō)明影響降香黃檀炭疽病發(fā)生和流行的主要因素是苗圃或林間的溫濕度，尤其是苗圃濕度高時(shí)，非常有利于炭疽病傳播和蔓延。

本研究中，蜘蛛蘭炭疽菌在pH 4～6范圍尤其在pH為5時(shí)生長(zhǎng)良好，與廖旺姣等[14]對(duì)降香黃檀炭疽病另一種病原菌豆類(lèi)炭疽菌(C.truncatum)的研究結(jié)果一致，也與生產(chǎn)上調(diào)查了解到偏酸性黃壤土發(fā)生降香黃檀炭疽病危害比pH較高壤土嚴(yán)重的結(jié)果相符。

本研究中，不同碳源對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢具有一定影響，其中以D-果糖、蔗糖和D-木糖等為碳源的菌絲生長(zhǎng)較好，產(chǎn)孢量較大，與董文統(tǒng)[6]的研究結(jié)果相似；而蜘蛛蘭炭疽菌菌絲在D-麥芽糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，產(chǎn)孢量也最小，與朱英芝等[16]、王義勛等[17]報(bào)道的油茶炭疽病菌(C.gloeosporioides)生物學(xué)特性一致。在氮源利用方面，本研究中蜘蛛蘭炭疽菌菌在酵母粉、牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，與朱英芝等[16]的研究結(jié)果一致；在硫酸銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，即硫酸銨對(duì)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，與江正君等[18]對(duì)漆樹(shù)炭疽病菌(C.gloeosporioides)的研究結(jié)果一致；蜘蛛蘭炭疽菌在牛肉膏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，說(shuō)明牛肉膏氮源有利于蜘蛛蘭炭疽菌產(chǎn)孢，與王義勛等[17]對(duì)油茶炭疽病病原菌、范曉龍等[19]對(duì)南方紅豆杉膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，光照既可促進(jìn)蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長(zhǎng)，也可促進(jìn)產(chǎn)孢，與孔瓊等[20]對(duì)枇杷炭疽病菌(C.gloeosporioides)的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

降香黃檀蜘蛛蘭炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢受溫度、pH、碳氮源和光照影響明顯，適宜的高溫和高濕有利于其病原菌分生孢子萌發(fā)。因此，生產(chǎn)上可根據(jù)該菌的生物學(xué)特性進(jìn)行有效防控。