丁紅映，田宇豪，李 青，楊佳怡，胡新喜，熊興耀,2，秦玉芝*

(1.湖南農業(yè)大學園藝園林學院 /湖南省馬鈴薯工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；2.中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosunL.)是茄科茄屬一年生草本植物，具有極高的營養(yǎng)價值，是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的世界第四大糧食作物，在我國種植區(qū)域廣泛，面積和產量均居世界首位[1-2]。我國南方冬作區(qū)馬鈴薯種植時間主要在晚秋、冬季和早春，期間常常遭遇霜凍以及持續(xù)低溫天氣，影響幼苗正常生長，造成減產甚至絕收[3]。因此，研究馬鈴薯材料的耐寒性，選育耐寒性品種，是南方冬作區(qū)馬鈴薯產業(yè)發(fā)展的重要手段之一?！厩叭搜芯窟M展】 低溫脅迫會導致植物細胞結構、成分及代謝過程與中間產物的一系列變化。因此，生理響應分析是研究植物耐寒性常見的手段。研究發(fā)現馬鈴薯在同等光合有效輻射下，凈光合速率隨環(huán)境溫度的下降而降低，10 ℃條件下的馬鈴薯凈光合速率與基因型耐寒性呈正相關[4]。植物代謝過程中產生的活性氧(ROS)動態(tài)平衡會因低溫脅迫被打破，使得ROS含量急劇増加或者先上升后下降趨勢，不同基因型石榴ROS含量增幅不同，且到達峰值的溫度也不同[5-6]。環(huán)境溫度變化顯著影響細胞含水量。其中，不同低溫處理過程中自由水/束縛水比值變化關注較多。普遍認為自由水/束縛水比值較低，細胞液濃度高，保水能力強，植物耐寒能力較強[7]。脯氨酸是一種親水性有機溶劑，與細胞水勢呈負相關。魏亮等發(fā)現馬鈴薯植株脯氨酸含量與耐寒性之間具有高度相關性，耐寒性越強的植株脯氨酸含量越高[8]。丙二醛(MDA)能夠引發(fā)化學加成作用，使生物膜中的結構蛋白和酶發(fā)生聚合和交聯，喪失了原有的結構和催化功能，抑制細胞保護酶活性和降低抗氧化物的含量，從而加劇膜脂過氧化[9]。MDA 含量越高，膜脂過氧化程度越高，說明膜受傷越嚴重。黃超等研究表明，甜瓜在4℃低溫處理8h后，不同品種間的丙二醛含量達到極顯著水平，隨著脅迫時間增加，丙二醛含量升高，但其顯著水平有所降低[10]。植物低溫脅迫生理響應研究一直備受關注，但由于植物耐寒性途徑的多樣性與復雜性仍無法提出完整的耐寒機制?！颈狙芯壳腥朦c】本研究通過對不同耐寒性馬鈴薯材料的抗氧化酶活性，滲透調節(jié)物質和膜脂過氧化3種生理途徑中關鍵因子進行耐寒性關聯綜合分析，評價這些生理指標在馬鈴薯耐寒性特征的貢獻率大小?！緮M解決的關鍵問題】采用主成分分析、隸屬函數和聚類分析法，綜合評價16份馬鈴薯材料的耐寒性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其低溫處理

試驗于2018年10月初，在湖南農業(yè)大學馬鈴薯工程中心進行，供試的16份馬鈴薯材料：隴薯8號、隴薯7號、中薯11號、華彩1號、300046.22、冀張14號、acanle-6、中薯8號、acanle-4、396034.268、F170、黃麻子、E1、AV9、AV1、634777。組培苗擴繁，每一種資源5瓶，每瓶5～6株，在光照強度3200 lx，光周期為光照/黑暗(14/10 h)，溫度為20～22 ℃的組培室，生長25 d，移栽于栽培盆中，置于光照強度為4000 lx，光周期為光照/黑暗(14/10 h)，溫度為20～22 ℃的人工氣候室，生長50 d。

將離體馬鈴薯功能葉片置于程序降溫儀，脅迫溫度為-3 ℃，脅迫時間為6 h。低溫脅迫處理后的葉片，混合取樣，測定各項生理生化指標，每個指標重復3次。同時，以正常生長溫度(20 ℃)、脅迫時間為0 h為對照。

1.2 指標的測定與數據分析

過氧化氫酶(CAT) 活性、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、過氧化物酶(POD) 活性參照李合生的測定方法[11]。游離脯氨酸(PRO)含量采用酸性茚三酮法，可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍法，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法。每個指標重復3次。測試分析是根據試劑盒的說明(科銘，蘇州)利用可見分光光度計測定分析。

耐寒系數和隸屬函數參照謝季堅[12]的方法:

耐寒系數(%)=處理條件下的測量值/對照條件下的測量值×100 %

(1)

耐寒系數轉換為隸屬函數公式如下:

隸屬函數u(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

反隸屬函數u(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

式中，u(Xij)第i個品種第j個指標的隸屬函數值。Xij為耐寒系數，Xmin為參試品種中第j個指標耐寒系數的最小值、Xmax為參試品種中第j個指標耐寒系數的最大值。如果耐寒指標與耐寒程度呈正相關，用公式(2)計算，反之，則用公式(3)計算。

利用Microsoft Excel 2010進行數據處理，利用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析、主成分分析、隸屬函數、聚類分析。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯不同生化指標的影響及耐寒系數分析

根據1.2耐寒系數的計算公式，求出各單項指標的耐寒系數。由各單項指標的耐寒系數可看出，不同馬鈴薯材料，生理生化指標都發(fā)生了變化(表1)。分析過氧化氫酶(CAT)活性，超氧化物歧化酶(SOD)活性，過氧化物酶(POD)活性等抗氧化酶。其中，CAT活性耐寒系數“F170”的值最大，為1.663±0.244，“acanle-6”的值最小，為0.562±0.19；SOD活性耐寒系數“F170”的值也是最大，為5.926±0.041，“隴薯7號”最小，為0.582±0.005； POD活性耐寒系數“300046.22”的值最大，為1.923±0.035，“acanle-6”的值最小，為0.528±0.036。由表1可知，這3種抗氧化酶的耐寒系數極值存在顯著性的差異(P<0.05)。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終產物，是膜系統受害的重要標志。MDA含量的耐寒系數“AV1”最大，為1.832±0.045，“acanle-4”最小，為0.745±0.067。

表1 低溫脅迫下16個馬鈴薯材料生理生化指標的變化

分析滲透調節(jié)物質在低溫響應中的變化，游離脯氨酸(PRO)含量耐寒系數“AV9”最大，為3.826±0.518 %，“634777”最小，為0.658±0.043，說明不同馬鈴薯通過PRO來提高對低溫的脅迫的能力存在差異性；可溶性糖(SS)含量耐寒系數“AV1”最大，為4.533±0.306，“隴薯8號”最小，為0.429±0.03；可溶性蛋白(SP)含量耐寒系數 “黃麻子”最大，2.140±0.183耐寒性，“634777”最小，為0.542±0.097耐寒性。

2.2 不同馬鈴薯材料7個生化指標主成分分析

從表2可知，在相關系數矩陣中，CAT、SOD、POD活性，游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量7個單項指標間存在一定的相關性，造成7個指標間信息的交叉。不同的指標系數對不同材料的耐寒性的評價不盡相同。采用主成分分析法對各項進行綜合評價。

表2 馬鈴薯幼苗耐寒性指標間的相關性

對16個馬鈴薯材料的CAT酶活性，SOD酶活性，POD酶活性，游離脯氨酸含量，可溶性糖含量，可溶性蛋白含量和丙二醛含量7個指標的耐寒系數進行主成分分析，由表3可知，將7個單項指標轉化成7個相互獨立的綜合指標前4個綜合指標(CI1-CI4)的貢獻率分別是34.829 %，22.108 %，14.48 %，12.312 %，累計貢獻率達83.729 %(大于80 %)，表明采用這4個相互獨立的綜合指標可以對不同馬鈴薯材料的耐寒性進行鑒定，具有較強的代表性。根據成分矩陣來看，在4個相互獨立的綜合的指標中，丙二醛(0.925)，SOD酶活性(0.757)，可溶性蛋白(0.717)，SOD酶活性(-1.07)活性指標占了較大的比重，SOD酶活性是綜合指標2(CI2)和綜合指標4(CI4)的關鍵因素，發(fā)生了信息間的重疊，所以可以將這3個指標看作是影響馬鈴薯耐寒性的關鍵因素。

表3 各綜合指標的系數以及貢獻率

2.3 不同馬鈴薯材料耐寒性綜合評價

2.3.1 隸屬函數分析 從表4可知，在低溫脅迫下，綜合指標U1中，“AV1”的值最大(1.000)，“中薯8號”最小(0)，說明在CI1這一綜合指標上，“AV1”的耐寒性最強，“中薯8號”耐寒性最弱，同理，在CI2 這一綜合指標上，“F170”的耐寒性最強，“300046.22”的耐寒性最弱；在CI3這一綜合指標上，“華彩1號”的耐寒性最強，“acanle-6”的耐寒性最弱，在CI4 這一綜合指標上，“AV9”的耐寒性最強，“冀張14號”的耐寒性最弱。綜合評價得，“黃麻子”耐寒性最強，“634777”耐寒性最弱。

2.3.2 權重的確定 根據4個綜合指標的貢獻率的大小，計算得到4個綜合指標的權重分別是0.416，0.264，0.173，0.147。

2.3.3 綜合評價 根據公式，計算得到不同馬鈴薯材料的綜合耐寒能力D值(表4)，“黃麻子”最大(0.667)，說明其耐寒性最強，“634777”最小(0.168)，其耐寒性最弱。根據D值對16份馬鈴薯材料的耐寒能力排序：“黃麻子”>“AV1”>“F170”>“AV9”>“華彩1號”>“隴薯8號”> “acanle-4”>“中薯11號”>“396034.268”>“300046.22”>“中薯8號”>“冀張14號”>“隴薯7號”>“acanle-6”>“E1”>“634777”。

表4 不同材料的綜合指標值，權重，U(X)，D值以及綜合評價

2.4 隸屬函數和聚類分析

將16份馬鈴薯材料的CAT、SOD、POD活性，游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量主成分分析的D值，進行隸屬函數和聚類分析(表5)，隸屬函數法對試驗材料進行排序，耐寒性鑒定的隸屬函數度0.7≤u(x) ≤1為強耐寒；0.3 ≤u(x) ≤0.69 為中等耐寒；0.00≤u(x)<0.29為弱耐寒。強耐寒材料3份，包括“黃麻子”、“AV1”和“F170”，中等耐寒材料7份，其中“AV9”、“華彩1號”和“隴薯8號”排名比較靠前。弱耐寒材料6份，其中“63477”和“E1”耐寒性最差。聚類分析分成3類，見圖1。鑒定出Ⅰ類(強耐寒)材料2份，包括“黃麻子”和“AV1”，Ⅱ類(中等耐寒)材料8份，分別為“F170”、“AV9”、“華彩1號”、“中薯8號”、“acanle-4”、“中薯11號”、“396034.268”、“300046.22”。Ⅲ類(弱耐寒)材料6份，分別為“中薯8號”、“冀張14號”、“隴薯7號”、“acanle-6”、“E1”、“634777”。

表5 馬鈴薯材料隸屬函數和聚類分析耐寒性分級

圖1 16份馬鈴薯材料耐寒性的系統聚類結果

3 討 論

逆境導致活性氧的積累使自由基的產生與清除這一動態(tài)平衡打破，從而造成膜系統的損傷甚至瓦解，導致膜脂過氧化終產物 MDA 含量的增加，細胞膜系統是低溫冷害發(fā)生的首要部位,低溫引起的細胞器膜結構的破壞是導致植株寒害損傷和死亡的根本原因[17]。所以丙二醛的含量，在一定程度上代表了膜脂受傷害的程度，也能夠反應植物耐寒性的強弱。在本研究中，丙二醛是馬鈴薯耐寒性的首要關鍵因子。植物的耐寒性是由多個基因控制的數量性狀，采用單一的指標、單一分析方法難以準確評價植物的耐寒性[18]。本研究測定低溫脅迫下16份馬鈴薯材料7個生化指標，采用主成分分析，隸屬函數和聚類分析3種分析方法對研究材料的耐寒性進行了綜合評價。研究結果認為二醛含量、可溶性蛋白含量和SOD活性可作為評價馬鈴薯耐寒性的重要參考指標，這3個指標涉及膜脂過氧化，抗氧化酶和滲透調節(jié)3種不同的生理響應過程，再次說明馬鈴薯耐寒性的復雜性。