李亞蘭，潘存德，陳 虹

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院/新疆教育廳干旱區(qū)林業(yè)生態(tài)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

【研究意義】核桃(JuglansregiaL.)系胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)多年生落葉喬木，又名胡桃，是世界重要的古老堅(jiān)果樹種之一[1-2]。其堅(jiān)果富含油脂、礦物質(zhì)元素和維生素等，是一種具有極高營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值的食品[3-4]。新疆作為我國核桃的重要產(chǎn)區(qū)之一，不僅有野生核桃的種質(zhì)資源分布，而且有千年以上悠久的栽培歷史[5-6]，在自然和人為的雙重作用下孕育了豐富的核桃種質(zhì)資源。植物豐富的種質(zhì)資源是種質(zhì)挖掘利用、保護(hù)及其相關(guān)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)，而對(duì)其表型性狀的鑒定評(píng)價(jià)則是挖掘利用的前提和依據(jù)。同時(shí)表型性狀評(píng)價(jià)還是種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)不可或缺一分，具有簡(jiǎn)便直觀的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于不同植物種質(zhì)的分類鑒定和核心種質(zhì)的構(gòu)建[7-8]。其中，植物果實(shí)性狀是比較穩(wěn)定的遺傳特征，在分類與鑒定中具有重要價(jià)值[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】R語言因其開源性、可移植性、靈活性等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的科研人員所喜愛和使用，目前主要用于生態(tài)學(xué)[10]、基因差異表達(dá)[11]、田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析[12]等方面的工作，但鮮有研究者將其應(yīng)用于種質(zhì)分類、形態(tài)及遺傳變異的相關(guān)研究。為了提供核桃育種工作表型性狀選擇的標(biāo)準(zhǔn)[13-15]，目前已有不少學(xué)者基于核桃堅(jiān)果表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性的研究，但未見利用R語言進(jìn)行其遺傳多樣性研究的相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究將R語言應(yīng)用于核桃種質(zhì)資源堅(jiān)果表型性狀的調(diào)查與分析，旨在揭示能夠鑒定核桃種質(zhì)資源的有效表型性狀指標(biāo)。【擬解決的關(guān)鍵問題】為今后R語言應(yīng)用于核桃遺傳多樣性研究提供新的數(shù)據(jù)分析方法，以期為今后采用形態(tài)學(xué)分析與分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法挖掘優(yōu)質(zhì)核桃種質(zhì)資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以新疆核桃產(chǎn)區(qū)南疆盆地和田、喀什、阿克蘇地區(qū)廣泛收集的52份人工栽培的鄉(xiāng)土核桃種質(zhì)作為材料。其中，栽培品種42份，實(shí)生優(yōu)良單株10份(表1)。

表1 供試核桃種質(zhì)編號(hào)及名稱

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堅(jiān)果表型性狀測(cè)定方法 針對(duì)每一份供試種質(zhì)，在果實(shí)成熟期其盛果期植株上隨機(jī)摘取成熟的果實(shí)10個(gè)，剝?nèi)ネ夤さ玫降膱?jiān)果晾干至恒重后測(cè)定其表型性狀。首先，參考《植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測(cè)試指南—核桃屬》(GB/T26909-2011，2011)進(jìn)行堅(jiān)果表型質(zhì)量性狀指標(biāo)測(cè)定，其中包括14個(gè)多態(tài)性性狀指標(biāo)，即：沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、橫切面形狀、果基形狀、果肩形狀、果頂突出程度、脊分布、脊寬度、脊突出程度、脊旁凹槽深度、核殼顏色、核仁顏色、隔膜質(zhì)地和內(nèi)褶壁特征。然后針對(duì)完成表型質(zhì)量性狀指標(biāo)測(cè)定后的每一份種質(zhì)的堅(jiān)果，進(jìn)行堅(jiān)果表型數(shù)量性狀指標(biāo)測(cè)定。堅(jiān)果表型數(shù)量性狀指標(biāo)包括9個(gè)，即：?jiǎn)喂亍⒊鋈事?、縱徑、橫徑、側(cè)徑、核殼厚度、核仁粗脂肪含量、核仁粗蛋白含量和果形指數(shù)。其中，核仁粗脂肪含量測(cè)定采用索氏提取法[16]，核仁粗蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法[17]。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析方法 對(duì)堅(jiān)果表型多態(tài)型指標(biāo)與數(shù)量性狀指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后，將其轉(zhuǎn)變?yōu)樘摂M變量，構(gòu)建缺失(0)或存在(1)二元型數(shù)據(jù)矩陣，從而產(chǎn)生由74個(gè)表型性狀(C1～C74)組成的原始矩陣(表2)。采用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對(duì)原始矩陣進(jìn)行聚類分析，并對(duì)分類數(shù)量的穩(wěn)定性進(jìn)行銳度測(cè)試(10 000次迭代)，顯著性水平為α=0.05，以確定最優(yōu)分類等級(jí)；對(duì)其進(jìn)行熱圖分析，最后采用多元回歸樹(multivariate regression trees，MRT)方法構(gòu)建多元回歸樹，對(duì)能夠區(qū)分供試種質(zhì)的最少表型性狀進(jìn)行量化。

表2 核桃堅(jiān)果表型性狀觀測(cè)指標(biāo)

利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理和計(jì)算；利用R語言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。使用MULTIV v2.4軟件進(jìn)行群銳度化測(cè)試[18](Test of group sharpness)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堅(jiān)果表型多樣性

從質(zhì)量性狀統(tǒng)計(jì)情況來看，供試種質(zhì)堅(jiān)果表型涵蓋了堅(jiān)果表型性狀指標(biāo)觀測(cè)類型。從數(shù)量性狀來看，供試核桃種質(zhì)也呈現(xiàn)多樣性(表3)：?jiǎn)喂?MN)的均值為15.95 g，變異系數(shù)為0.25，變異幅度為18.08～26.07 g；縱徑(NL)的均值為44.17 mm，變異系數(shù)為0.13，變異幅度為31.67～56.60 mm；橫徑(NW)的均值為35.81 mm，變異系數(shù)為0.09，變異幅度為30.02～42.36 mm；側(cè)徑(NH)的均值為38.19 mm，變異系數(shù)為0.23，變異幅度為31.24～47.71 mm；果形指數(shù)(INS)的均值為1.20，變異系數(shù)為0.11，變異幅度為0.96～1.47；殼厚(HT)的均值為1.45 mm，變異系數(shù)為0.23，變異幅度為0.61～2.06 mm；出仁率的均值為45.69 %，變異系數(shù)為0.13，變異幅度為36.72 %～69.10 %；粗脂肪含量(CFC)的均值為62.43 %，變異系數(shù)為0.10，變異幅度為45.89 %～75.05 %；粗蛋白含量(CPC)的均值為17.56 %，變異系數(shù)為0.15，變異幅度為12.36 %～23.64 %。變異系數(shù)最大的指標(biāo)為NW，最大值為26.07 g，最小值為8.00 g。

表3 核桃種質(zhì)數(shù)量性狀的變異分析

2.2 堅(jiān)果表型聚類

基于供試核桃種質(zhì)堅(jiān)果表型進(jìn)行聚類分析，以群銳度測(cè)試進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可將其劃分為2個(gè)不同的組(圖1)：G1包括JR09、JR50、JR19、JR25、JR20、JR24、JR04、JR15、JR13、JR02、JR34、JR16、JR46、JR45、JR28、JR47、JR49、JR23、JR48、JR52、JR29、JR32、JR30、JR27、JR21、JR10、JR42、JR08和JR11共29份種質(zhì)，其共同特征是單果重>15.0 g，側(cè)徑<35.78 mm；G2包括JR06、JR22、JR07、JR12、JR03、JR31、JR26、JR01、JR39、JR37、JR36、JR43、JR38、JR40、JR05、JR44、JR17、JR51、JR35、JR14、JR41、JR18和JR33共23份核桃種質(zhì)，其共同特征是單果重<15.0 g，側(cè)徑>35.78 mm。

圖1 基于核桃堅(jiān)果表型的聚類分析(UPGMA)

針對(duì)G1群體再次進(jìn)行銳度測(cè)試，將其分為11個(gè)亞群：G1′(JR09、JR50)、G2′(JR19、JR25)、G3′(JR20、JR24)、G4′(JR04)、G5′(JR15、JR13、JR02、JR34、JR16、JR46)、G6′(JR45、JR28)、G7′(JR47、JR49、JR23、JR48)、G8′(JR52)、G9′(JR29)、G10′(JR32、JR30)、G11′(JR27、JR21、JR10、JR42、JR08、JR11)；針對(duì)G2群體再次進(jìn)行銳度測(cè)試，將其分為10個(gè)亞群：G12′(JR06)、G13′(JR22)、G14′(JR07、JR22)、G15′(JR03、JR31、JR26、JR01、JR39、JR37)、G16′(JR36、JR43、JR38)、G17′(JR38、JR40)、G18′(JR05、JR44、JR17、JR51、JR35)、G19′(JR14)、G20′(JR41、JR18、JR33)。

2.3 熱圖

根據(jù)對(duì)52份種質(zhì)的堅(jiān)果表型性狀數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化的二元矩陣，應(yīng)用R語言進(jìn)行聚類熱圖分析，將表型性狀與種質(zhì)分類結(jié)果直觀展示，熱圖中性狀缺失(0)用灰色表示，性狀存在(1)則用紅色表示(圖2)。聚類熱圖結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果一致，性狀缺失(0)或性狀存在(1)將結(jié)果分為兩大類。

從圖2可以看出，52份種質(zhì)堅(jiān)果表型性狀的分布共同集中的性狀分布于內(nèi)褶壁退化(C46)、橫膈膜膜質(zhì)(C44)、核仁黃色(C40)。G1群體中種質(zhì)共同的堅(jiān)果表型性狀主要分布于單果重>15.0 g(C48)和側(cè)徑<35.78 mm(C55)；G2群體中種質(zhì)共同的堅(jiān)果表型性狀主要分布于單果重8.0～15.0 g(C47)。同時(shí)表型性狀在不同種質(zhì)間的存在獨(dú)特分布，單份種質(zhì)中JR48與其他種質(zhì)共有23個(gè)指標(biāo)，其殼厚-厚殼(C64)性狀與其他種質(zhì)明顯區(qū)分；JR38種質(zhì)其沿縫合線縱切面三角形(C2)性狀與其他種質(zhì)明顯區(qū)分；JR01種質(zhì)其出仁率低(C65)性狀與其他種質(zhì)明顯區(qū)分；JR52種質(zhì)其內(nèi)褶壁革質(zhì)(C45)性狀與其他種質(zhì)明顯區(qū)分。

圖2 基于核桃堅(jiān)果表型性狀的聚類熱圖

2.4 多元回歸樹(MRT)

應(yīng)用52份供試核桃種質(zhì)核桃的74個(gè)堅(jiān)果表型性狀指標(biāo)構(gòu)建多元回歸樹，按照殼厚-厚殼(C64)這一性狀為根節(jié)點(diǎn)開始劃分，最后生成52個(gè)終結(jié)點(diǎn)樹狀分支(圖3)。圖3中性狀存在(1)在右邊分支，性狀不存在(0)在左邊分支，其中沿縫合線縱切面圓形(C1)、沿縫合線縱切面卵圓形(C3)、垂直于縫合線縱切面卵圓形(C7)、垂直于縫合線縱切面橢圓形(C8)、橫切面圓形(C11)、脊分布上1/2(C25)、脊分布上2/3(C26)、脊分布貫通(C27)、單果重8.0～15.0 g(C47)、果形圓形(C58)、果形長(zhǎng)圓(C59)、殼厚-紙皮(C61)、殼厚-薄殼(C62)、殼厚-厚殼(C64)、出仁率中(C66)共15個(gè)性狀指標(biāo)能夠區(qū)分供試種質(zhì)。即沿縫合線縱切面形狀(C1～C5)、垂直于縫合線縱切面形狀(C6～C10)、橫切面形狀(C11～C12)、脊分布(C25～C27)、單果重(C47～C48)、果形(C58～C60)、核殼厚度(C61～C64)、出仁率(C65～C68)是區(qū)分供試種質(zhì)的重要性狀。

圖3 基于核桃堅(jiān)果表型性狀的多元回歸樹

3 討 論

植物表型性狀為植物遺傳多樣性的最直接反映，除了是衡量其遺傳多樣性的重要途徑和關(guān)鍵指標(biāo)[19]，還對(duì)揭示植物的基因型具有重要意義[20]，并對(duì)農(nóng)林生產(chǎn)中品種選擇與育種工作有重要影響。此外，在某些情況下，植物表型性狀可以有效地進(jìn)行園藝植物種質(zhì)的鑒定與分類。如莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)種質(zhì)的菜葉形狀、肉質(zhì)莖和肉瘤形狀[21]，紫蘇(Perillafrutescens)種質(zhì)的真葉顏色、葉型等[22]表型性狀的差異均成為其鑒定分類的重要指標(biāo)，明顯的表型性狀差異使得部分種質(zhì)成為易于識(shí)別的特色種質(zhì)。國內(nèi)外在對(duì)核桃種質(zhì)表型性狀所表征的遺傳多樣性研究中，普遍采用核桃堅(jiān)果性狀指標(biāo)，如巴基斯坦[23]、土耳其[24]、阿爾巴尼亞[25]等國鄉(xiāng)土核桃品種的表型多樣性分析。本研究中采用的26個(gè)堅(jiān)果表型性狀均為國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)中作為核桃種質(zhì)分類的重要指標(biāo)[26-27]，除此之外，本研究還將堅(jiān)果品質(zhì)性狀(核仁粗脂肪、粗蛋白含量)同樣作為種質(zhì)鑒定的重要指標(biāo)，對(duì)堅(jiān)果表型質(zhì)量性狀與數(shù)量性狀進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試種質(zhì)具有豐富的表型多樣性。

聚類分析的實(shí)質(zhì)是綜合考察大量性狀指標(biāo)，利用多元統(tǒng)計(jì)分析將供試對(duì)象分到相對(duì)同質(zhì)的群組中的一種數(shù)學(xué)方法，已在植物表型性狀的研究中獲得良好效果，如有學(xué)者利用不同番茄(Lycopersiconesculentum)種質(zhì)表型性狀進(jìn)行聚類找到性狀突出、具有利用價(jià)值的新材料[28]，同時(shí)許多表型性狀研究中所得聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果及分子標(biāo)記分類結(jié)果一致，證明基于表型性狀的種質(zhì)分類具有一定的遺傳特征[29-30]。但聚類分析側(cè)重于種質(zhì)間關(guān)系差異的量化分析[31]，采用不同的聚類參數(shù)和聚類算法可能得到不同的分類結(jié)果，因此有學(xué)者提出群體銳度測(cè)試[32]來確定最佳的分類數(shù)量，這種方法已廣泛應(yīng)用于不同植物分類研究工作中，如菊科植物花粉分類研究[33]，以及巴西學(xué)者對(duì)胡椒科不同植物的分類[34]，目前并未有報(bào)道將其運(yùn)用于園藝作物品種的分類鑒定工作。本研究中堅(jiān)果表型性狀聚類分析后的群體銳度測(cè)試得到明顯區(qū)分的兩個(gè)類群(G1、G2)，各類群中的種質(zhì)具有相同的堅(jiān)果性狀。即使進(jìn)行第二次銳度測(cè)試，G5′(6份種質(zhì))、G7′(4份種質(zhì))、G11′(6份種質(zhì))、G15′(6份種質(zhì))、G18′(5份種質(zhì))仍然各自聚為一類，說明從堅(jiān)果表型角度考慮，其親緣關(guān)系較近。此外，有少數(shù)種質(zhì)間具有相同唯一性狀，但它們并未組成明顯的分類群體，其原因可能是聚類過程中更多考慮大部分種質(zhì)共有的堅(jiān)果性狀。

聚類熱圖是將數(shù)據(jù)的相似性與差異性利用顏色的梯度及相似程度直觀的表現(xiàn)出來的一種方法，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)量與基因表達(dá)的趨勢(shì)研究中[35-36]，同時(shí)在遺傳多樣性研究中，被用于對(duì)聚類分析結(jié)果的驗(yàn)證，直觀顯示供試種質(zhì)間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及物種多樣性信息[37-38]，而在表型多樣性研究中應(yīng)用較少。本研究中將表型性狀的有無以熱圖的形式顯示，能夠直觀表達(dá)供試種質(zhì)間形態(tài)分化關(guān)系及不同種質(zhì)間具有共有性狀分布情況，為揭示種質(zhì)鑒定中的重要表型性狀提供重要信息。熱圖顯示所有供試種質(zhì)分為兩大類，其分析結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果一致。表型性狀在不同種質(zhì)間的獨(dú)特分布，能夠顯示出堅(jiān)果表型性狀對(duì)種質(zhì)的區(qū)分情況，僅在少數(shù)種質(zhì)中存在的表型性狀是區(qū)分種質(zhì)的重要性狀。如沿縫合線縱切面三角形(C2)、內(nèi)褶壁革質(zhì)(C45)、殼厚-厚殼(C64)、出仁率低(C65)分別僅在JR38、JR52、JR48、JR01和4份種質(zhì)中存在，因此認(rèn)為核殼厚度、沿縫合線縱切面形狀、出仁率、內(nèi)褶壁等性狀能夠成為鑒定這4份核桃種質(zhì)的重要表型性狀指標(biāo)。

多元回歸樹的構(gòu)建會(huì)通過交叉驗(yàn)證對(duì)分類結(jié)果進(jìn)行剪枝處理，盡量避免樹過擬合的現(xiàn)象[39]，同時(shí)其構(gòu)建過程，就是變量的選擇過程。因此將MRT方法應(yīng)用于構(gòu)建種質(zhì)間相關(guān)關(guān)系，不僅能夠?qū)ζ溥M(jìn)行聚類，而且具有一定的預(yù)測(cè)功能[40-41]，在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，如對(duì)環(huán)境因子與多物種分布的相關(guān)關(guān)系研究中，對(duì)植物群落進(jìn)行合理地?cái)?shù)量分類[42]。還有在海底魚類群體生態(tài)學(xué)研究中，學(xué)者利用多元回歸樹量化環(huán)境對(duì)單一物種及海洋群落的影響[43]。本研究利用供試核桃種質(zhì)堅(jiān)果表型性狀構(gòu)建回歸樹，從MRT分類樹狀圖中直觀看出堅(jiān)果表型性狀與種質(zhì)間的關(guān)系，C1、C3、C7、C8、C11、C25、C26、C27、C47、C58、C59、C61、C62、C64、C66共15個(gè)堅(jiān)果表型性狀被用于構(gòu)建回歸樹，說明其對(duì)于供試種質(zhì)的區(qū)分與鑒定貢獻(xiàn)較大，而其余性質(zhì)則因影響較小而未在回歸樹中出現(xiàn)。因此認(rèn)為基于核桃種質(zhì)表型性狀鑒定種質(zhì)中，沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、橫切面形狀、脊分布、單果重、果形、核殼厚度、出仁率等性狀是種質(zhì)鑒定中重要的指標(biāo)性狀，這與以往的核桃種質(zhì)表型性狀研究結(jié)果一致[44-45]。此外，在分析中果形-圓形(C58)、殼厚-薄殼(C62)、出仁率-中(C66)等性狀多次將供試種質(zhì)分類，同樣說明核殼厚度、出仁率等性狀在核桃種質(zhì)鑒定中的重要地位。

4 結(jié) 論

52份供試核桃種質(zhì)堅(jiān)果表型多樣性豐富，沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、橫切面形狀、脊分布、單果重、果形、核殼厚度、出仁率等性狀是種質(zhì)鑒定中重要的指標(biāo)性狀，研究結(jié)果為核桃種質(zhì)資源基礎(chǔ)理論研究與育種研究提供基礎(chǔ)資料。此外，本文首次將R語言應(yīng)用于堅(jiān)果表型性狀的聚類分析，熱圖分析及多元回歸樹建立，為今后R語言應(yīng)用于核桃植物形態(tài)與遺傳變異研究提供新的數(shù)據(jù)分析方法。