趙 鳳，杜 娟，李尚偉*，張澤杰

(1.貴州大學(xué) 昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.遵義市第十八中學(xué)，貴州 遵義 563000)

【研究意義】海藻糖是一種非還原性雙糖，由2個(gè)葡萄糖分子經(jīng)半縮醛羥基結(jié)合而成，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和無脊椎動(dòng)物中[1-3]。在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下，海藻糖能在機(jī)體細(xì)胞表面形成獨(dú)特的保護(hù)膜，可有效保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持機(jī)體的生命過程和生物特征[4-5]。海藻糖在昆蟲體內(nèi)的唯一分解代謝途徑是在海藻糖酶(Tre)的作用下被水解為葡萄糖，葡萄糖最終作為細(xì)胞進(jìn)行糖酵解的原料，為昆蟲的各種生命活動(dòng)提供能量[6]。由于海藻糖在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的重要性，其又被稱為昆蟲的“血糖”[7-8]。海藻糖酶是昆蟲體內(nèi)唯一能水解海藻糖的酶類，在海藻糖代謝過程中至關(guān)重要，同時(shí)海藻糖酶也是幾丁質(zhì)合成通路中的第一個(gè)酶，在幾丁質(zhì)代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，海藻糖酶已經(jīng)成為防治害蟲的理想靶標(biāo)。【前人研究進(jìn)展】海藻糖酶(Tre)是昆蟲海藻糖代謝必不可少的一類酶，能專一催化1分子海藻糖水解為2分子葡萄糖。昆蟲中的海藻糖酶最先由Frerejacaque在1941年發(fā)現(xiàn)，隨后研究證實(shí)，昆蟲體內(nèi)存在2種類型的海藻糖酶，即可溶型海藻糖酶(Tre1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(Tre2)?？扇苄秃Ｔ逄敲钢饕嬖谟诶ハx消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)中，如血淋巴、中腸和馬氏管中，負(fù)責(zé)內(nèi)源性海藻糖的分解[9]；膜結(jié)合型海藻糖酶主要存在于昆蟲的肌肉中，其主要功能是水解食物中的海藻糖，從而為肌肉運(yùn)動(dòng)和取食階段中腸的運(yùn)動(dòng)提供能量[10]。海藻糖酶是由海藻糖酶基因編碼合成，海藻糖酶基因的表達(dá)和酶活性直接與蟲體正常發(fā)育、蛻皮、變態(tài)及繁殖等重要生理過程密切相關(guān)。1992年第一個(gè)可溶型海藻糖酶基因在黃粉蟲Tenebriomolitor中首次被克隆[9]，但第一個(gè)膜結(jié)合型海藻糖酶基因(CmTre2)直到2005年才在家蠶Bombyxmori中得以克隆驗(yàn)證[11]。到目前為止，已經(jīng)有多種昆蟲的海藻糖酶基因被克隆，如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、西方蜜蜂Apismellifera[12]、甜菜夜蛾Spodopteraexigua[13-14]、灰飛虱Laodelphaxstriatellus[15]及飛蝗Locustamigratoria[16]等。【本研究切入點(diǎn)】水稻是世界上重要的糧食作物之一，無論是田間還是儲(chǔ)存過程中會(huì)受到多種害蟲的危害。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis，俗稱卷葉蟲、刮青蟲、苞葉蟲等，屬于鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae，是對(duì)水稻危害最嚴(yán)重的主要害蟲之一[17-18]。該蟲是一種典型的遷飛性害蟲，在我國(guó)和國(guó)外分布均廣泛[19]。稻縱卷葉螟主要危害水稻和玉米等禾本科作物，其幼蟲綴絲縱卷水稻葉片成蟲苞，幼蟲匿居蟲苞之中取食葉肉，使葉片僅留表皮，形成白色條斑，影響水稻光合作用，造成水稻秕谷增加，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅下降[18]?；瘜W(xué)防治因其防效好、收效快、使用方便等特點(diǎn)，目前仍是一項(xiàng)防治害蟲的主要措施，但大面積使用化學(xué)農(nóng)藥，容易造成農(nóng)藥殘留且殺傷天敵，導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性。迄今為止，一些關(guān)于利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)沉默害蟲靶標(biāo)基因的研究[20-24]為害蟲的綠色防控展現(xiàn)出光明的前景?！緮M解決的關(guān)鍵問題】運(yùn)用RNAi技術(shù)沉默膜結(jié)合型海藻糖酶基因(CmTre2)的表達(dá)，定時(shí)觀察稻縱卷葉螟對(duì)水稻的取食情況、蟲體表型變化，并檢測(cè)靶標(biāo)基因表達(dá)水平的變化及海藻糖酶活性變化，以期為進(jìn)一步明確該基因在稻縱卷葉螟生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要作用，以及利用RNAi防治該害蟲提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：稻縱卷葉螟由貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[25]，在人工氣候箱內(nèi)用稻苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度(26±1) ℃，相對(duì)濕度70 %～80 %，光周期14L:10D。

主要試劑與儀器：HP Total RNA Kit購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit和GeneJET RNA Purification Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA marker、PrimeScript RT-PCR Kit及LATaqDNA聚合酶均購(gòu)于大連TaKaRa公司；pGEM-T Easy載體購(gòu)于美國(guó)Promega公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix、Gel Extraction Kit和C1000 Thermal Cycler購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；海藻糖酶活力測(cè)定試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；顯微注射器、PCR耗材、離心管及其他常規(guī)試劑和耗材均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì) 根據(jù)CmTre2的開放閱讀框(ORF)，通過3個(gè)在線RNAi寡核苷酸靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)工具(http://siDirect2.RNAi.jp；http://biotools.idtdna.com/Scitools/Applications/RNAi/RNAi.aspx；http://optirna.unl.edu)，尋找具有較多Dicer酶切位點(diǎn)且無脫靶效應(yīng)的靶標(biāo)序列。用同樣方法在維多利亞多管發(fā)光水母Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白(GFP)基因(GenBank：CAA58789)中設(shè)計(jì)1個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)，作為對(duì)照。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 利用Primer Premier 6.0針對(duì)上述靶序列設(shè)計(jì)PCR引物和合成dsRNA所需引物，在合成dsRNA所需每條引物的5′端加上一段20 bp的T7啟動(dòng)子序列，目的是使體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子能形成dsRNA。另外，根據(jù)CmTre2、稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因(CmCHSA)和幾丁質(zhì)合成酶B基因(CmCHSB)的ORF設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)引物，以稻縱卷葉螟看家基因CmActin(GenBank登錄號(hào)：JN029806)為內(nèi)參對(duì)照，檢測(cè)CmTre2、CmCHSA和CmCHSB的mRNA表達(dá)水平。引物信息見表1。

表1 稻縱卷葉螟膜結(jié)合型海藻糖酶基因的dsRNA合成引物和RT-qPCR引物

1.2.3 dsRNA的合成與注射 用表1中的引物對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用膠回收試劑盒純化，回收產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆。然后用帶T7啟動(dòng)子的引物按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo Fisher,USA)說明書分別合成CmTre2的dsRNA(dsCmTre2)和GFP的dsRNA(dsGFP)。體外轉(zhuǎn)錄體系：5×TranscriptAid eaction buffer 4 μl，ATP/CTP/GTP/UTP各2 μl，DNA模板(兩端帶T7啟動(dòng)子)4 μl，TranscriptAid enzyme mix 2 μl，加Nuclease-free ddH2O補(bǔ)足至20 μl。在PCR儀中37 ℃反應(yīng)5 h后，分別加入2 μl DNase I和RNase A，孵育15 min去除冗余的DNA及單鏈RNA，再分別加入2 μl EDTA終止反應(yīng)。合成的dsRNA用GeneJET RNA Purification Kit(Thermo Fisher,USA)純化，使其濃度大于3 μg/μl。

將體外合成的dsCmTre2和dsGFP注射到稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)后，觀察生長(zhǎng)發(fā)育的變化。選取大小一致、生長(zhǎng)健康和發(fā)育良好的稻縱卷葉螟3齡幼蟲，沿著血液流動(dòng)方向，分別在其腹部的8～10腹節(jié)間注射dsCmTre2，每頭蟲注射0.5 μl。以注射相同量dsGFP的稻縱卷葉螟作對(duì)照。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)注射20頭蟲。分別將注射dsRNA和沒注射的幼蟲放在新鮮水稻葉片上，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察取食、表型及死亡情況。

1.2.4 沉默CmTre2及其對(duì)幾丁質(zhì)合成酶基因的影響 注射dsRNA后5 d，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組存活的幼蟲，提取總RNA，用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa,China)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。在C1000 PCR儀(Bio-Rad,USA)上進(jìn)行RT-qPCR，分別檢測(cè)CmTre2、CmCHSA和CmCHSB的表達(dá)水平。用稻縱卷葉螟看家基因CmActin作為內(nèi)參對(duì)照。RT-qPCR采用2步法程序：95 ℃預(yù)變性1 min；第1步95 ℃變性10 s，第2步60 ℃退火和延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線分析，以排除非特異性PCR產(chǎn)物的污染。每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 海藻糖酶活性測(cè)定 稱取0.1 g經(jīng)dsRNA干擾后存活的稻縱卷葉螟，加入1 mL冷磷酸緩沖液，在冰上勻漿，4 ℃離心10 min，取上清液，用海藻糖酶活力試劑盒(蘇州科銘生物)進(jìn)行海藻糖酶活力測(cè)定。以每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol葡萄糖作為一個(gè)酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用2-ΔΔCt法分析CmTre2、CmCHSA和CmCHSB基因mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0中方差分析(ANOVA)的Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因CmTre2的沉默效應(yīng)

RT-PCR結(jié)果顯示，稻縱卷葉螟在注射dsRNA后5 d，注射dsCmTre2的實(shí)驗(yàn)組CmTre2mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.463，注射dsGFP的對(duì)照組(CK)CmTre2mRNA相對(duì)表達(dá)量為1(圖1)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CmTre2的表達(dá)水平較下降53.70 %，二者間差異達(dá)極顯著水平，表明dsCmTre2能有效降低CmTre2的表達(dá)。

* 和**分別表示差異達(dá)顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平，下同

2.2 沉默CmTre2后稻縱卷葉螟的生長(zhǎng)發(fā)育

注射dsRNA后5 d，注射dsCmTre2的實(shí)驗(yàn)組幼蟲體型變小，蛻皮受阻，并出現(xiàn)畸形和死亡現(xiàn)象；注射dsGFP的對(duì)照組(CK)蟲體表型無明顯變化，生長(zhǎng)發(fā)育情況良好(圖2)。注射dsRNA后5 d，注射dsCmTre2存活幼蟲的平均體重為22 mg，對(duì)照組的平均體重為24.87 mg，注射dsCmTre2的幼蟲體重顯著小于對(duì)照組(圖3)。表明，干擾膜結(jié)合型海藻糖酶基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致稻縱卷葉螟不能正常生長(zhǎng)發(fā)育。

圖3 注射dsRNA后5 d存活稻縱卷葉螟幼蟲的體重

圖2 沉默CmTre2基因5 d后稻縱卷葉螟幼蟲的表型變化

從圖4可以看出，注射dsRNA第2天時(shí)，注射dsCmTre2幼蟲的死亡率為13.33 %，CK僅有1.667 %，兩者間的差異達(dá)顯著水平；第3天，注射dsCmTre2幼蟲的死亡率為25.00 %，CK僅有1.667 %，兩者間的差異達(dá)極顯著水平；注射dsRNA 5 d后，注射dsCmTre2幼蟲的死亡率(51.67 %)是CK死亡率(3.33 %)的15.52倍。表明，沉默CmTre2能對(duì)稻縱卷葉螟引起顯著的致死效應(yīng)。

圖4 注射dsRNA后稻縱卷葉螟幼蟲的死亡率

2.3 沉默CmTre2后幾丁質(zhì)合成酶基因基因的表達(dá)

從圖5可以看出，注射dsCmTre2 5 d后，幼蟲CmCHSA的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.858，與CK(dsGFP)相比下降不明顯；CmCHSB的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.6559，與CK相比下降34.41 %，達(dá)顯著水平。表明，注射dsCmTre2不僅對(duì)CmTre2具有明顯的沉默效應(yīng)，對(duì)下游基因的表達(dá)也有不同程度的影響。

圖5 注射dsRNA 5 d后幾丁質(zhì)合成酶基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 RNA干擾海藻糖酶的活性

從圖6看出，注射dsCmTre2后5 d，稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活性為2364.5413 U，為對(duì)照組的64.36 %，與對(duì)照組相比具有顯著差異。表明，dsCmTre2對(duì)稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活力具有明顯的抑制作用。

圖6 注射 dsRNA 5 d 后稻縱卷葉螟幼蟲的海藻糖酶活力

3 討 論

RNAi是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。目前，可以通過飼喂、注射和轉(zhuǎn)基因等多種方法將體外合成的siRNA或dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)，其中，注射法是干擾效果最明顯的方法[26]。RNAi具有高效性和特異性，被廣泛應(yīng)用于昆蟲領(lǐng)域的研究[27-30]。Chen等[14]的研究結(jié)果顯示，注射膜結(jié)合型海藻糖酶基因的dsRNA后，甜菜夜蛾S.exigua出現(xiàn)明顯的畸形個(gè)體，或進(jìn)入下一期的幼蟲明顯小于正常個(gè)體，死亡率明顯高于對(duì)照組。該研究采用注射法成功將dsCmTre2注射入稻縱卷葉螟3齡幼蟲的腹部，結(jié)果顯示幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育受抑制，蟲體變小，體重減輕，死亡率大幅增加，膜結(jié)合型海藻糖酶基因表達(dá)水平顯著下調(diào)；而注射dsGFP的對(duì)照組，CmTre2的表達(dá)水平及幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和體重等均未受影響。該研究結(jié)果與Chen等[14-15]分別干擾甜菜夜蛾S.exigua和灰飛虱L.striatellus中的膜結(jié)合型海藻糖酶基因時(shí)顯示的結(jié)果相一致。

海藻糖是昆蟲的血糖，昆蟲的各個(gè)組織器官利用海藻糖時(shí)必須先利用海藻糖酶將海藻糖降解為葡萄糖。在昆蟲蛻皮及合成幾丁質(zhì)等各種生命活動(dòng)中，都需要大量的海藻糖作為能源物質(zhì)為其提供能量。海藻糖酶活力的高低不僅影響海藻糖的降解，還與昆蟲血淋巴中糖類物質(zhì)的運(yùn)輸效率密切相關(guān)，當(dāng)昆蟲體內(nèi)海藻糖酶活力降低時(shí)，海藻糖去向減少，海藻糖含量升高，葡糖糖含量降低，血淋巴運(yùn)送糖類物質(zhì)的效率降低，這不僅會(huì)影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)影響幾丁質(zhì)的合成而產(chǎn)生致死效應(yīng)[16,31]。在昆蟲體內(nèi)，海藻糖酶活性受多種激素的調(diào)節(jié)[32-34]。蛻皮激素可以提高海藻糖酶活力并加快海藻糖酶基因的表達(dá)[35-36]。滯育激素能提高家蠶B.mori卵巢海藻糖酶活性[37]。此外，當(dāng)海藻糖酶基因的表達(dá)被干擾后，海藻糖酶活力也會(huì)降低。Zhao等[38]利用RNAi技術(shù)沉默褐飛虱Nilaparvatalugens海藻糖酶基因的表達(dá)，結(jié)果顯示注射dsRNA后海藻糖酶活力明顯降低，海藻糖酶含量增加，褐飛虱的生長(zhǎng)受抑制。對(duì)稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)注射dsCmTre2后，CmTre2基因表達(dá)量降低，海藻糖酶活性降低，造成昆蟲發(fā)育受阻，體重降低。該研究結(jié)果與Zhao等[15,38]的研究結(jié)果相吻合。

海藻糖酶是昆蟲海藻糖代中的一個(gè)關(guān)鍵酶，亦是幾丁質(zhì)合成通路上的第一個(gè)酶，能催化海藻糖水解成葡糖糖作為能源物質(zhì)和合成幾丁質(zhì)的原料，幾丁質(zhì)的合成和降解對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。近年來，甜菜夜蛾S.exigua、褐飛虱N.lugens和赤擬谷盜T.castaneum等多種昆蟲海藻糖酶-幾丁質(zhì)調(diào)控通路的研究結(jié)果均表明，海藻糖酶基因的表達(dá)對(duì)幾丁質(zhì)的合成與降解存在一定的調(diào)控作用。當(dāng)海藻糖酶基因的表達(dá)被抑制后，海藻糖酶活力降低，海藻糖含量增加，葡萄糖含量減少，影響幾丁質(zhì)合成通路下游基因表達(dá)，幾丁質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育受阻[38-39]。昆蟲擁有可溶型和膜結(jié)合型2種類型的海藻糖酶，功能上存在差異，Tre1和Tre2分別調(diào)控昆蟲不同部位幾丁質(zhì)的合成。Tre1主要在血淋巴、中腸和馬氏管中高表達(dá)，負(fù)責(zé)內(nèi)源性海藻糖的分解；Tre2主要在脂肪體、中腸和馬氏管中高表達(dá)，負(fù)責(zé)外源性海藻糖酶的分解[40-41]。在甜菜夜蛾S.exigua的研究中，當(dāng)SeTre1基因被干擾后，對(duì)幾丁質(zhì)合成酶A基因(CHSA)的影響較大，對(duì)幾丁質(zhì)合成酶B基因(CHSB)的影響很?。欢鳶eTre2基因被干擾后，對(duì)SeCHSA基因的影響較小，對(duì)SeCHSB基因的影響較大[14]。該研究中，當(dāng)CmTre2被干擾后，下游CmCHSB基因的mRNA表達(dá)量被顯著抑制，但對(duì)CmCHSA基因的表達(dá)影響較小，這可能與CHSA有可變剪切現(xiàn)象相關(guān)。Yang等[42]的研究結(jié)果表明，CHS1(CHSA)有2個(gè)可變轉(zhuǎn)錄本(CHS1a和CHS1b)，且CHS1a主要在表皮中表達(dá)，CHS1b主要在氣管中表達(dá)。在敲低CmTre2后，未檢測(cè)到CHSA表達(dá)量顯著降低，可能檢測(cè)的是CHS1a的mRNA表達(dá)量，下一步將針對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行更深入的研究。Zhao等[38]將NlTre的dsRNA注射到褐飛虱N.lugens體內(nèi)，結(jié)果表明，在48和72 h后幾丁質(zhì)合成酶基因的表達(dá)量明顯下降。類似的研究結(jié)果在飛蝗L.migratoria等昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)[39]。此外，張露等[43]在研究褐飛虱N.lugens海藻糖酶基因調(diào)控幾丁質(zhì)代謝的過程中發(fā)現(xiàn)，上游海藻糖酶基因被干擾后，對(duì)下游部分幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)也有明顯抑制作用，幾丁質(zhì)含量下降，褐飛虱出現(xiàn)蛻皮困難等現(xiàn)象。上述研究結(jié)果表明，海藻糖酶對(duì)昆蟲幾丁質(zhì)合成和降解都有一定的影響，導(dǎo)致昆蟲體重減輕，生長(zhǎng)受阻，甚至出現(xiàn)大幅死亡現(xiàn)象。

近年來，隨著昆蟲RNAi機(jī)制的闡明，科學(xué)家們?cè)诔晒﹁b定多種昆蟲基因功能的同時(shí)，將該技術(shù)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治的研究也取得了突破性的進(jìn)展[44-45]。幾丁質(zhì)是昆蟲外骨骼、中腸和氣管等器官的重要組分，對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。因此，明確幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因在害蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要作用，將為深入發(fā)掘昆蟲致死基因作為RNAi的靶標(biāo)提供理論依據(jù)。Arakane等[46]在赤擬谷盜T.castaneum的蛹和幼蟲血腔內(nèi)注射幾丁質(zhì)合成酶基因TcCHS1和TcCHS2的dsRNA，發(fā)現(xiàn)在幼蟲-幼蟲、幼蟲(蛹和蛹(成蟲3個(gè)階段，均可導(dǎo)致試蟲因蛻皮困難，無法擺脫舊表皮而致死。通過顯微注射的方法分別沉默G6PI和UAP基因，可分別致使桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis出現(xiàn)蛻皮困難的致死表型[47]。該研究通過RNAi干擾技術(shù)沉默CmTre2后，稻縱卷葉螟幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育受阻，體重減輕，出現(xiàn)畸形，最終因幾丁質(zhì)的合成受阻導(dǎo)致死亡，這與幾丁質(zhì)合成通路上的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶基因、幾丁質(zhì)合成酶基因的干擾現(xiàn)象[47-48]相似。

4 結(jié) 論

通過注射dsRNA到稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)，成功抑制了CmTre2的表達(dá)，海藻糖酶活力降低，幾丁質(zhì)合成受阻，導(dǎo)致稻縱卷葉螟生長(zhǎng)發(fā)育受阻，體重減輕，出現(xiàn)畸形表型，最終導(dǎo)致死亡。該研究為進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)在田間防治稻縱卷葉螟奠定基礎(chǔ)，為該害蟲的綠色防控開辟新的領(lǐng)域。