徐如飛，金哲晨，許 良，蔣培蓉，陳美雯，孫梅好，蒲首丞,2*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004; 2.浙江華茗園茶業(yè)有限公司，浙江 永康 321300)

安吉白茶是綠茶類植物，其茶葉擁有低溫敏感的特性，浙江湖州的安吉縣是其盛產(chǎn)之地[1]。安吉白茶含有許多有效的保健成分，具有提神消乏、降低血脂和保護(hù)牙齒等作用[2]。其中，茶多酚是茶葉中主要的有效成分之一。茶多酚又叫茶單寧或茶鞣質(zhì)[3]，在茶葉干基中的含量為15%～35%，遠(yuǎn)高于其他植物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚具有消除人體自由基與抵抗衰老、預(yù)防心血管病、促進(jìn)血糖血脂減低、抗癌治病、改善腸道吸收、抑菌、抗輻射、沉淀重金屬等一些特殊有效的藥理作用[4-11]。安吉白茶在清明后有大量的“粗老茶”，茶葉口感風(fēng)味較差，直接飲用價(jià)值較低，容易滯銷。優(yōu)化安吉白茶水溶性多酚提取工藝，可對低值老茶葉加以利用，擴(kuò)大安吉白茶的經(jīng)濟(jì)效益。目前，國內(nèi)對安吉白茶中茶多酚提取的研究報(bào)道較少。茶多酚普遍分布在細(xì)胞內(nèi)，使用水浴超聲提取的方法不但環(huán)保且具有較高的安全性，且可有效地破碎細(xì)胞并加速茶多酚的向外滲透[12]，縮短提取時(shí)間。而響應(yīng)面法不局限于孤立的試驗(yàn)點(diǎn)，可在試驗(yàn)范圍連續(xù)進(jìn)行分析得出最優(yōu)方案。因此選擇超聲波提取方法，響應(yīng)面法優(yōu)化安吉白茶水溶性茶多酚提取的最佳條件，以期為安吉白茶水溶性多酚的工業(yè)化開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

安吉白茶，購于安吉縣茶葉市場。

儀器：UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津UV-2550；BT-224S電子天平，德國賽多利斯；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；5810R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

試劑：沒食子酸、福林酚試劑和碳酸鈉試劑均為分析純；試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用高精度電子天平準(zhǔn)確稱量5 mg的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸樣品，并用去離子水在50 mL容量瓶中準(zhǔn)確定容，配制成0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取0 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL和1.50 mL標(biāo)準(zhǔn)液，然后分別吸取0.5 mL的福林酚試劑和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉試劑依次加入后，去離子水定容至25 mL，搖晃均勻，平行3組。在常溫下做遮光處理，進(jìn)行避光反應(yīng)0.5 h，避光反應(yīng)結(jié)束后，使用紫外分光光度計(jì)，在765 nm波長處測各組樣品的吸光度。以配制的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測得的吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得到回歸方程式[13-14]：

A=0.104 2C+ 0.014 8 (R2=0.992 1)

1.2.2 安吉白茶中茶多酚的提取及含量測定 取50 g 安吉白茶，置于研缽中研碎，將粉末保存于錐形瓶中，密封待用。

稱取安吉白茶粉末0.5 g，裝入50 mL試管中，以100℃去離子水為溶劑，水浴超聲下提取一段時(shí)間，過濾定容后分別吸取2 mL的樣品溶液至4支試管里，分別將等量的0.5 mL福林酚試劑與2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉試劑依次移加，定容并做遮光處理及吸光度的測定，根據(jù)之前的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，將得到的數(shù)據(jù)代入回歸方程計(jì)算安吉白茶粉末中茶多酚含量[13-14]。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 在較高溫度下茶多酚提取量較高，為便于控制溫度，在100℃左右進(jìn)行試驗(yàn)，對水浴超聲的提取時(shí)間、提取茶多酚次數(shù)及安吉白茶與去離子水的料液比進(jìn)行分析，通過單因素試驗(yàn)考察各因素提取茶多酚的最佳條件[13]。

1) 料液比。在超聲處理0.5 h，安吉白茶與去離子水的料液比(g∶mL，下同)分別為1∶20、1∶40、1∶60和1∶80條件下各提取1次，測定茶多酚含量，下同。

2) 提取時(shí)間。在料液比1∶20，超聲處理時(shí)間分別為0.5 h、1 h、1.5 h和2 h條件下各提取1次。

3) 提取次數(shù)。在料液比為1∶20，超聲提取時(shí)間0.5 h條件下分別提取1次、2次、3次和4次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[15-17]基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，取安吉白茶與水的料液比、水浴超聲提取的時(shí)間以及提取次數(shù)3個(gè)因素作為自變量，安吉白茶多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過Design Expert 8.0.6對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸解析，得到安吉白茶多酚提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。其因素水平見表1。

表1 超聲波提取安吉白茶茶多酚的響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.2.5 最佳工藝的驗(yàn)證 在響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳工藝條件下進(jìn)行安吉白茶茶多酚的提取，并進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對安吉白茶茶多酚提取量的影響

從圖1看出不同料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)的安吉白茶茶多酚含量變化。

2.1.1 料液比 隨著料液比的增加，提取到的安吉白茶茶多酚含量先急劇增多，后增加速率變慢，當(dāng)料液比超過1∶60后，提取到的茶多酚含量減少。因?yàn)榱弦罕仍黾訉⒂兄诎布撞璧牟瓒喾雍徒嵋褐g的分子接觸及向外溢出，從而利于多酚的提取。但試驗(yàn)使用的是超聲波輔助提取法，其原理是通過共振使細(xì)胞破裂。當(dāng)液料比增大到1∶60之后，整個(gè)溶液體系的體積過于龐大，使超聲波的共振效果下降，從而導(dǎo)致提取效果下降。因此，料液比宜在1∶60左右。

2.1.2 提取時(shí)間 隨著提取時(shí)間的不斷延長，安吉白茶水溶性多酚的含量呈先增后降趨勢，1 h時(shí)，安吉白茶水溶性多酚的含量增加非常迅速，且其含量達(dá)較大值，為141.6 mg/g。這是因?yàn)樘崛r(shí)間太短，安吉白茶中的茶多酚無法被完全的有效提取出來，而當(dāng)超聲提取時(shí)間太長時(shí)，茶多酚可能會被緩慢氧化，導(dǎo)致最后含量下降。因此超聲提取的適宜時(shí)間應(yīng)為1 h。

2.1.3 提取次數(shù) 隨著提取次數(shù)增多，安吉白茶水溶性多酚的含量也不斷增加，從1次到3次的提取過程中，茶多酚含量的增長趨勢明顯，在3次提取后，茶多酚含量增長趨勢有所下降?？紤]到提取次數(shù)增多，時(shí)間與成本都會增加，故提取次數(shù)選擇3次為宜。

2.2 安吉白茶茶多酚的最佳提取工藝

2.2.1 二次回歸模型的建立 對表2中不同處理的安吉白茶茶多酚提取量進(jìn)行回歸解析得到回歸模型：Y=181.46+6.11A+3.08B+4.39C+0.97AB-0.2AC-0.78BC-3.08A2-5.96B2-1.88C2。

表2 超聲提取安吉白茶的茶多酚提取量

經(jīng)方差分析，該回歸模型的P<0.000 2，失擬項(xiàng)P=0.622 4，回歸模型極顯著(P<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，表明二次線性回歸方程顯著，重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)擬合良好，可以對響應(yīng)值進(jìn)行很好的預(yù)測。其中因素A、B、C和B2對水溶性茶多酚提取率為顯著影響(P<0.01)。各種因素對提取水溶性多酚的影響從小到大依次為料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析 從圖2可知，提取次數(shù)固定條件下，伴隨超聲波輔助提取時(shí)間的延長，水溶性茶多酚含量呈先增后減趨勢。而料液比若不斷增大，水溶性茶多酚的含量也呈增長趨勢且增大的速率逐步變緩。料液比對水溶性茶多酚含量的影響小于提取時(shí)間，與方差分析一致。此外，等高線圖的最中心總體為橢圓形，提取時(shí)間和提取料液比間相互作用顯著，且最高點(diǎn)落于試驗(yàn)區(qū)間，說明料液比和提取時(shí)間的最適條件在探究范圍內(nèi)，可根據(jù)最高點(diǎn)對應(yīng)的數(shù)值得出最適條件。

從圖3可知，響應(yīng)面表現(xiàn)為一個(gè)斜面，提取時(shí)間固定時(shí)，無論是增加提取次數(shù)還是增大安吉白茶與去離子水的比例，水溶性茶多酚含量均呈逐漸增加并趨于平穩(wěn)的趨勢。分析等高線圖發(fā)現(xiàn)，無法找到高點(diǎn)，最高點(diǎn)偏離試驗(yàn)區(qū)間，且等高線表現(xiàn)為接近正圓，表示提取次數(shù)與提取料液比間的相互作用不顯著。

從圖4可知，若提取時(shí)間延長，水溶性茶多酚含量呈先增后減的變化。若提取次數(shù)增多，水溶性茶多酚含量呈先增后平穩(wěn)變化。從響應(yīng)面的坡度分析可知，提取時(shí)間對水溶性茶多酚含量的影響較提取次數(shù)更顯著，提取次數(shù)和時(shí)間的相互作用也相對顯著。

2.2.3 最佳工藝及驗(yàn)證 采用Box.Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法預(yù)測最優(yōu)工藝為安吉白茶與去離子水的料液比為1∶49.12(g∶mL)，提取時(shí)間為1.10 h，提取次數(shù)為3.99次，預(yù)測茶多酚提取量為187.1 mg/g。按得出的理論最優(yōu)工藝略作調(diào)整進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)驗(yàn)證，在安吉白茶與去離子水的料液比為1∶50(g∶mL)，提取時(shí)間為1.10 h，提取次數(shù)為4次時(shí)，得到茶多酚提取量為188.5 mg/g，實(shí)測值與預(yù)測值的差異為1.4 mg/g。與理論預(yù)測值基本符合，均在187 mg/g左右，表明模型擬合程度良好?？紤]到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)時(shí)無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)室的精度要求，及大規(guī)模生產(chǎn)的效率問題，綜合RSM和提取成本，建議最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶50(g∶mL)、提取時(shí)間66 min、提取次數(shù)為3次，此時(shí)水溶性茶多酚提取含量為182.6 mg/g。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，安吉白茶茶多酚提取的最佳工藝是料液比1∶50(g∶mL)、提取時(shí)間66 min、提取4次?？紤]到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)時(shí)無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)室的精度要求，及大規(guī)模生產(chǎn)的效率問題，綜合RSM和提取成本，建議最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶50(g∶mL)、提取時(shí)間66 min、提取3次，此時(shí)水溶性茶多酚提取含量為182.6 mg/g。

茶葉可溶性多酚用途十分廣泛，在臨床醫(yī)藥[18]，保健品藥學(xué)[19]、美容化妝[20-21]和蔬果保鮮[22]等中均可應(yīng)用。采用輔助超聲波破碎提取技術(shù)，較傳統(tǒng)的茶多酚提取方法在操作方法上更簡便，提取含量更多，性價(jià)比更高。