李斯陶 武祥睿 崔旭杰 李道朋 劉師君 唐保宏

摘 要：為提高蛹蟲草的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本、提高蛹蟲草種植業(yè)的收益，進(jìn)行了以部分培養(yǎng)基替換為菌渣對于蛹蟲草生長影響的研究。通過菌渣替代比例及蠶蛹粉添加試驗(yàn)和栽培試驗(yàn)，利用Graphpad Prism 8軟件對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，最終確定培養(yǎng)基的最優(yōu)配方：在添加4g蠶蛹粉的條件下，菌渣替代比例為10%，可以在不影響子實(shí)體形態(tài)的前提下，縮短栽培時(shí)間，降低畸形率，并顯著提高蛹蟲草的產(chǎn)量，提高蛹蟲草種植的收益。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草;菌渣;栽培基質(zhì);產(chǎn)量

中圖分類號 Q815文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）09-0036-04

Study on the Cultivation of Cordyceps militaris （L.） Fr. with Edible Fungus Residue Partially Replacing Conventional Substrate

Li Sitao et al.

（School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

Abstract：In order to increase the yield of Cordyceps militaris （L.） Fr.，reduce the cost of culture medium，and improve the income of Cordyceps militaris （L.） Fr. cultivation，the effect of replacing some culture medium with waste rod on the growth of Cordyceps militaris （L.） Fr. was studied. Through comparing with the fresh weight of Cordyceps militaris （L.） Fr. fruiting body in the pre experiment，and using Graphpad Prism 8 statistics software to collate and analyze the data，the better formula of the culture medium was determined：the mass ratio of rice to waste rod was 9∶1 under the condition of adding silkworm cnysalis power 4g. It can shorten the cultivation time，reduce the deformity rate，improve the output of Cordyceps militaris （L.） Fr. and reduce the cost of Cordyceps militaris （L.） Fr. culture medium without affecting the fruiting body shape.

Key words：Cordyceps militaris （L.） Fr.; Mushroom Dregs; Cultivation Substrate; Output

蛹蟲草[（Cordyceps militaris （L.） Fr.）]又名北冬蟲夏草，是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹上形成的子座與菌核的復(fù)合體[1]，其除具有抗微生物、抗癌、抗氧化等多種藥用價(jià)值以外[2]，還具有生產(chǎn)茶飲[3]、醬[4]、香醋[5]和米酒[6]等的食用價(jià)值。目前蛹蟲草栽培技術(shù)較為成熟，但在大規(guī)模工廠化生產(chǎn)中，多以蠶蛹、大米、小麥等栽培基質(zhì)，成本較高[7-10]。我國是食用菌生產(chǎn)大國，在香菇、平菇栽培中使用木屑等原料作為基質(zhì)，經(jīng)過多次出菇后會產(chǎn)生大量的廢棄菌渣。菌渣殘留有大量未利用完全的有機(jī)質(zhì)及菌絲體，具有豐富的營養(yǎng)成分[11-12]，且具有疏松多孔的特性[13]，有利于真菌菌絲體的生長。目前利用食用菌菌渣進(jìn)行栽培草菇、榆黃蘑、蒜苗等方面的研究較多[14-16]，但利用食用菌菌渣栽培蛹蟲草的研究相對較少[17]。本研究探討了平菇栽培廢棄菌渣替代常規(guī)原料栽培蛹蟲草的可行性，既保證蛹蟲草子實(shí)體的產(chǎn)量及品質(zhì)、降低生產(chǎn)成本，又實(shí)現(xiàn)了廢棄菌渣的資源化利用，為廢棄菌渣大規(guī)模替代傳統(tǒng)基質(zhì)生產(chǎn)蛹蟲草提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 試驗(yàn)菌種為鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌多樣性與利用實(shí)驗(yàn)室保藏蛹蟲草真菌Cordyceps militaris TC02。馬鈴薯、大米由超市采購;蠶蛹粉采購自鄭州市陳寨花卉市場;平菇菌渣采購自惠州逍遙生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司;葡萄糖購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉、蛋白胨、酵母膏均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;VB1購自西安錦源生物科技有限公司;KH2PO4購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;MgCl2購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備 光照培養(yǎng)箱（LRH-250-G）：上海賀杰儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器（KYC-100B）：上海圣科儀器設(shè)備有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-78A）：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;雙人桌面（水平）凈化工作臺（RZ-2D2G）：廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱（101A）：廣州滬瑞明儀器有限公司;霉菌培養(yǎng)箱（MJ-70-I）：蘇州維菱電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制及菌種的保藏活化 采用PDAY培養(yǎng)基（配制參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行），其中酵母粉含量為2g/L。制備液體培養(yǎng)基[19]，其中VB1 10mg、蛋白胨3g、MgCl2 0.5g、KH2PO4 1g、pH值7.0，并分裝后每瓶添加15粒玻璃珠，于115 ℃下滅菌20min。

營養(yǎng)液配制參考文獻(xiàn)進(jìn)行[20]，其中蛋白胨10g/L、酵母膏1g/L、MgSO4 0.5g/L，且不含葡萄糖。

1.3.2 菌種活化及液體菌種制備 將蛹蟲草母種接種至PDAY培養(yǎng)基平板上，在23℃避光條件下培養(yǎng)7d得到活化菌種。

在蛹蟲草活化平板上用打孔器無菌操作制備直徑為6mm的菌餅，向含100mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中接種3～4塊菌餅，搖床內(nèi)進(jìn)行避光150r/min振蕩培養(yǎng)，溫度為25℃，5d獲得糊狀菌絲體的菌液。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 菌渣替代比例及蠶蛹粉添加試驗(yàn) 菌渣替代試驗(yàn)在200mL培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行，含20g培養(yǎng)基質(zhì)和30mL營養(yǎng)液。以20g大米為對照，分別研究了菌渣比例為5%、10%、15%和20%時(shí)栽培基質(zhì)對子實(shí)體鮮重的影響。接種量為5mL/瓶，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)平行，接種好的培養(yǎng)基，在25℃、相對濕度為65%左右的條件下暗培養(yǎng)3d左右，至菌絲穿透并長滿培養(yǎng)基，表面出現(xiàn)一些隆起后，在22℃、相對濕度為75%左右、200～400lx光照條件下培養(yǎng)5～7d[21-23]。至培養(yǎng)基完全轉(zhuǎn)為橙色后，進(jìn)行溫差處理，溫差保持在5℃左右（白天溫度控制在25℃，晚上溫度控制在20℃），其他條件不變，培養(yǎng)10d左右[23]，至小刺尖狀突起形成、原基分化后開始進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，條件控制為22℃、相對濕度為85%～90%、光照強(qiáng)度為700～1000lx，并每天按光照10h、黑暗14h進(jìn)行培養(yǎng)[24]，培養(yǎng)35d左右，當(dāng)子實(shí)體尖端稍有膨大時(shí)即可采收，檢測子實(shí)體鮮重?？疾煨Q蛹粉添加對子實(shí)體鮮重影響時(shí)每瓶補(bǔ)加4g蠶蛹粉[25]，接種量和培養(yǎng)條件等同上，子實(shí)體成熟時(shí)檢測鮮重。

1.3.3.2 栽培試驗(yàn) 栽培試驗(yàn)處理類型及基質(zhì)配比見表1，營養(yǎng)液添加量、蠶蛹粉添加量、接種量和培養(yǎng)條件同1.3.3.1。每個(gè)處理設(shè)置8個(gè)平行，定期觀察子實(shí)體生長形態(tài)，待子實(shí)體成熟時(shí)對子實(shí)體成熟用時(shí)、子實(shí)體個(gè)數(shù)、鮮重、干重、畸形率和生物學(xué)效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 數(shù)據(jù) 將每個(gè)處理中子實(shí)體已經(jīng)成熟的組別分別進(jìn)行收集，并統(tǒng)計(jì)其培養(yǎng)成熟時(shí)所用時(shí)間、所采集的子實(shí)體個(gè)數(shù)，至全部采集完畢計(jì)算每個(gè)處理的平均培養(yǎng)時(shí)間及平均子實(shí)體個(gè)數(shù)。每采集1瓶子實(shí)體后，稱量其鮮重并統(tǒng)計(jì)其中畸形子實(shí)體鮮重（將生長出來形狀不規(guī)則、不同于一般子實(shí)體的子實(shí)體均判定為畸形子實(shí)體，一般貼壁生長），后置于80 ℃干燥箱中烘干至恒重后稱量干重[26]，至全部采集完畢計(jì)算每個(gè)處理的平均鮮重、平均畸形子實(shí)體鮮重及平均干重。

采用如下公式計(jì)算生物學(xué)效率[27]：生物學(xué)效率（%）=蛹蟲草平均鮮重/培養(yǎng)基干料重×100;采用如下公式計(jì)算畸形率：畸形率（%）=畸形子實(shí)體總鮮重/子實(shí)體總鮮重×100。

數(shù)據(jù)處理采用軟件Graphpad Prism 8進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌渣替換比例對子實(shí)體鮮重的影響 以20g大米為對照研究了不同菌渣替換比例對子實(shí)體鮮重的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可見，5%、10%組與CK相比子實(shí)體鮮重有所增加，15%、20%組與CK相比子實(shí)體鮮重略有下降，但經(jīng)成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析后，每一組與CK相比差異不顯著（P>0.05）。

2.2 蠶蛹粉對子實(shí)體鮮重的影響 添加蠶蛹粉條件下不同菌渣替換比例對子實(shí)體鮮重影響的結(jié)果見圖2。由圖2可知，與CK相比，添加蠶蛹粉后的0%、5%、10%、15%及20%組子實(shí)體鮮重均有所增加，經(jīng)成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)后，添加蠶蛹粉后0%和5%組與CK相比差異具有顯著性（P<0.05），添加蠶蛹粉的10%、15%及20%組與CK相比差異極顯著（P<0.01）。

2.3 栽培試驗(yàn)的基質(zhì)配方對蛹蟲草成熟用時(shí)、子實(shí)體個(gè)數(shù)影響 按栽培試驗(yàn)的基質(zhì)配方栽培蛹蟲草時(shí)，可以縮短蛹蟲草的栽培周期（表2）。在菌渣替換比例適當(dāng)時(shí)，栽培周期會明顯縮短，最多相差1.9d。當(dāng)替換比例達(dá)到10%時(shí)，栽培時(shí)間最短，平均耗時(shí)54.1d。繼續(xù)提高菌渣的替換比例，栽培時(shí)間反而會提升。將部分大米替換為菌渣對生長出的子實(shí)體個(gè)數(shù)有較大影響（圖3），總體來說，在一定的菌渣添加比例范圍內(nèi)，子實(shí)體的生長個(gè)數(shù)隨著菌渣替換比例的增加而不斷增加。因此，菌渣替換量越大，每根子實(shí)體的平均鮮重就越小，但子實(shí)體的粗細(xì)更為均一。由于菌渣中含有的殘留菌絲體提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，且具有疏松多孔的結(jié)構(gòu)，增加了培養(yǎng)基質(zhì)的透氣性，不僅可以減少培養(yǎng)時(shí)間，又可以很大程度上促進(jìn)原基的形成。

2.4 栽培試驗(yàn)基質(zhì)配方對蛹蟲草產(chǎn)量的影響 通過t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌渣替換量在5%、10%、15%、20%及25%處理組的子實(shí)體平均鮮重均高于對照組（表3），其中菌渣替換量為10%的處理組與對照組的差異極顯著（P=0.004），子實(shí)體鮮重最高為13.4g/瓶。而菌渣替換量為35%處理組的平均鮮重則明顯低于對照組（P=0.009）。向大米培養(yǎng)基中部分替換菌渣對蛹蟲草的生物學(xué)效率有一定影響（圖4），生物學(xué)效率最高為54.97%。

處理組中除35%組子實(shí)體干重平均值低于對照組外，其他組均高于對照組，其中10%、15%、20%替換組與對照組的差異極顯著，25%替換組與對照組的差異具有顯著性，可見適量菌渣的替換可以增加蛹蟲草子實(shí)體的平均干重。

2.5 栽培試驗(yàn)基質(zhì)配方對蛹蟲草畸形率的影響 由圖5可見，替換菌渣處理組的畸形率均略小于對照組，且畸形率最低的為替換比例30%的處理組。事實(shí)上，畸形率從大體上是隨著菌渣替換比例的升高而降低的。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，用適當(dāng)比例的菌渣替換掉一些目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的大米栽培基質(zhì)，能夠進(jìn)行蛹蟲草的栽培生產(chǎn)，但對產(chǎn)量增加等影響并不顯著。經(jīng)進(jìn)一步改良添加蠶蛹粉后，可以在不影響子實(shí)體形態(tài)的前提下縮短栽培時(shí)間、降低畸形率，且顯著地提高蛹蟲草的產(chǎn)量。因此，最適合蛹蟲草生長及子實(shí)體形成的栽培基質(zhì)配方：在添加4g蠶蛹粉的條件下，菌渣的替換比例為10%。

可能是由于菌渣較為疏松多孔，從而使栽培基質(zhì)的透氣性增加，增加了菌絲體的生長速度，同時(shí)菌渣上殘留的營養(yǎng)物質(zhì)和蠶蛹粉提供的生長因子促進(jìn)了蛹蟲草子實(shí)體原基的形成。根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果可知，適當(dāng)?shù)靥砑有Q蛹粉可使蛹蟲草的子實(shí)體產(chǎn)量及蟲草素含量提升。因此雖然添加蠶蛹粉使成本有所升高，但菌渣作為種植食用菌后的廢棄物，成本低廉且便于獲取，在擴(kuò)大栽培規(guī)模時(shí)可以在成本略升高甚至不增加的情況下，使蛹蟲草產(chǎn)量顯著提高，以此增加蛹蟲草種植的收益。

參考文獻(xiàn)

[1]Dong Cui Jian. Biotechnological production and applications of Cordyceps militaris，a valued traditional Chinese medicine[J]. Critical Reviews in Biotechnology，2014，35（4）：475-484.

[2]Shonkor Kumar Das，Mina Masuda，Akihiko Sakurai，et al. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris：Current state and prospects[J]. Fitoterapia，2010，81（8）：961-968.

[3]岳春.蛹蟲草保健茶飲料的研制[J].中國釀造，2008（18）：90-93.

[4]孫連海，郭明月，王凱.蛹蟲草保健醬的加工工藝研究[J].中國調(diào)味品，2015，40（11）：73-76.

[5]彭凱.蛹蟲草香醋生產(chǎn)工藝研究[J].中國調(diào)味品，2017，42（11）：83-84.

[6]劉竹青，于梅.蛹蟲草甜米酒的釀造工藝研究[J].中國釀造，2017，36（09）：177-181.

[7]Bin Wen，Rongmin Yu，Xiufeng Bai. Studies on polysaccharide in the tissue cultures of Cordyceps militaris[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University，2000，17（5）：361-364.

[8]黃寶菊.蛹蟲草人工栽培研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2015，46（1）：75-77.

[9]王雅玲，鄭雙雙，呂國忠，等.我國蛹蟲草人工栽培培養(yǎng)基的現(xiàn)狀調(diào)查[J].食用菌，2009（1）：4-5.

[10]楊杰，程紅艷，韓曉芳，等.蛹蟲草人工栽培研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（7）：123-126.

[11]董雪梅，王延鋒，孫靖軒，等.食用菌菌渣綜合利用研究進(jìn)展[J].中國食用菌，2013，32（06）：4-6.

[12]劉景坤，吳松展，程漢亭，等.食用菌菌渣基質(zhì)化利用研究進(jìn)展[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（01）：197-204.

[13]王新華，李欣，劉廣青，等.廢棄菌棒生物炭對土壤中鎘和鉛的固持和植物吸收性的影響[J]. 能源與環(huán)保，2019，41（01）：97-103，107.

[14]韓建東，萬魯長，楊鵬，等.食用菌菌渣栽培榆黃蘑技術(shù)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（3）：117-119.

[15]李正鵬，余昌霞，黃建春，等.三種食用菌菌渣部分替代廢棉栽培草菇[J].食用菌學(xué)報(bào)，2016，23（1）：27-30.

[16]劉明廣，張新紅，龔雪梅，等.平菇菌渣栽培蒜苗的試驗(yàn)[J].食用菌，2015，37（2）：64-65.

[17]Qunying Lin，Liangkun Long，Liangliang Wu，et al. Evaluation of different agricultural wastes for the production of fruiting bodies and bioactive compounds by medicinal mushroom Cordyceps militaris[J]. J Sci Food Agric，2017，97（10）：3476-3480.

[18]孫明.對蜱致病性球孢白僵菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（7）：1022-1030.

[19]林群英，宋斌，鐘月金，等.蛹蟲草人工栽培條件優(yōu)化研究[J].中國食用菌，2006 （06）：21-23.

[20]胡健微，秦秀麗.蛹蟲草人工培養(yǎng)營養(yǎng)基質(zhì)的優(yōu)化試驗(yàn)[J].食用菌，2013，35（05）：29-31.

[21]吳春華，常廣寧，侯秀明，等.栽培條件優(yōu)化對蛹蟲草及其菌絲體生長的影響[J].上海蔬菜，2016（4）：64-67.

[22]韓雪，賈成發(fā)，陳帥，等.不同碳源對蛹蟲草菌絲生長的影響[J].食用菌，2012（03）：16，28.

[23]王蘭珍，林桂榮.不同培養(yǎng)條件對蛹蟲草原基形成的影響[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2009（4）：44-45.

[24]高曉梅，陳月仍.光照對人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體形成和生長的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（6）：33-34.

[25]葉晶晶，張劍飛，曹寧寧，等.添加蠶蛹粉和改變營養(yǎng)液pH對人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量及蟲草素含量的影響[J].蠶業(yè)科學(xué)，2013（3）：217-220.

[26]車振明，王燕，周黎黎，等.原生質(zhì)體紫外誘變選育蛹蟲草新菌種的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004（8）：38-41.

[27]Douglas A Diehle，Daniel J Royse. Shiitake Cultivation on Sawdust：Evaluation of Selected Genotypes for Biological Efficiency and Mushroom Size[J]. Mycologia，1986，78（6）：929-933.

（責(zé)編：王慧晴）