袁曉倩，韓 晶，簡龍海，陳 靜，毛北萍，鄭 榮

(上海市食品藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局化妝品監(jiān)測評價重點實驗室，上海 201203)

雙酚類和烷基酚類化合物是生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的重要原料，被廣泛應用于食品、化妝品包裝材料、醫(yī)療器械、工業(yè)及家用洗滌劑等領域[1-4]。作為典型的雌激素類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，這兩類化合物具有不易降解和易蓄積的特性，從空氣到土壤均有被污染的風險[5]。內(nèi)分泌干擾物可以通過食物鏈進入機體，并在體內(nèi)富集，對生物體具有基因毒性、生殖發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾效應，并且對嬰幼兒的危害尤為嚴重[6-8]。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)和歐盟化妝品法規(guī)(EC No 1223/2009)明確規(guī)定雙酚A、壬基苯酚與支鏈4-壬基苯酚為化妝品中的禁用物質(zhì)，但目前尚未收載相關檢驗方法[9-10]。因此，迫切需要開發(fā)同時測定多種雙酚類及烷基酚類內(nèi)分泌干擾物的檢測方法，并應用建立的分析方法對化妝品樣品進行全面調(diào)研。

目前，國內(nèi)外關于雙酚A、4-壬基苯酚和4-辛基苯酚的檢測方法主要有電化學法[11-12]、高效液相色譜法[13-15]、分光光度法[16]、毛細管電泳法[17]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[18]、氣相色譜-質(zhì)譜法[19-20]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-26]等。但光譜法、色譜法存在選擇性差、靈敏度低等不足，無法解決化妝品基質(zhì)復雜的問題，陽性樣品需經(jīng)質(zhì)譜進一步確證。而現(xiàn)有的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法響應低，需進一步優(yōu)化色譜與質(zhì)譜條件。此外，目前已有文獻報導的檢測方法覆蓋化合物較少，僅限于1～2種化妝品基質(zhì)。

本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法對化妝品中的雙酚類化合物(雙酚A、雙酚S、雙酚F)和烷基酚類化合物(對特辛基苯酚、2,4-二叔丁基酚、支鏈4-壬基苯酚、4-辛基苯酚、4-壬基苯酚)進行檢測。建立的方法快速靈敏、分離度好，能滿足化妝品中相關物質(zhì)的檢測要求，從而為化妝品的日常監(jiān)督和風險評估提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；API 6500型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國Absciex公司)；分析天平(德國Sartorius公司)；MS 3 digital渦旋混合器(德國IKA公司)；5810 R離心機(德國Eppendorf公司)；Milli-Q Advantage A-10型超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

雙酚S(純度99.30%)、雙酚F(純度99.81%)、雙酚A(純度99.60%)、對特辛基苯酚(純度98.65%)、4-辛基苯酚(純度99.28%)、4-壬基苯酚(純度99.72%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；2,4-二叔丁基酚(純度99.80%，德國CNW公司);支鏈4-壬基苯酚(純度99.80%，美國o2si標準品公司);雙酚A內(nèi)標(純度99.00%，美國CDN標準品公司)；甲醇、乙腈(色譜級，Merck公司)；氨水(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)。實驗用水由Milli-Q超純水機制備。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Waters X-Bridge BEH Phenyl液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；流動相：0.1% 氨水(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序：0～3 min，70%～40% A；3～10 min，40%～10% A；10～15 min，10% A；15～15.1 min，10%～70%A；15.1～18 min，70%A。

1.2.2 質(zhì)譜條件離子化模式：負離子電噴霧離子化(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；氣簾氣壓力(CUR)：1.72×105Pa，氮氣；離子源噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化溫度(TEM)：450 ℃；霧化氣壓力(GAS1)：55 psi(3.79×105Pa)，氮氣；加熱輔助氣(GAS2)：50 psi(3.45×105Pa)，氮氣；離子駐留時間均為50 ms；各化合物的檢測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表1 9種目標分析物的監(jiān)測離子對及相關電壓參數(shù)Table 1 Monitor ion pairs and voltage parameters of 9 target analytes

(續(xù)表1)

1.3 標準溶液的配制

精密稱取雙酚A內(nèi)標標準品10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取0.1 mL置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的同位素內(nèi)標工作溶液。

分別精密稱取8種待測物標準品10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合標準儲備溶液，于4 ℃冰箱保存。

分別精密吸取上述混合標準品溶液和同位素內(nèi)標工作溶液適量，用甲醇稀釋成8種標準品質(zhì)量濃度為0.005、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的系列待測物標準工作溶液，內(nèi)標溶液質(zhì)量濃度均為10 ng/mL。

1.4 樣品前處理

粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類化妝品：準確稱取化妝品樣品約1.0 g，精確至0.001 g，置于25 mL玻璃比色管中，加入250 μL雙酚A內(nèi)標工作溶液(1 μg/mL)，再加入乙腈-1%氨水(4∶1，體積比)混合溶液定容至刻度，渦旋混勻，超聲提取30 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，濾液作為待測液備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇由于待測的烷基酚類化合物中包含同分異構(gòu)體，其具有相同的母離子和子離子，因此需選擇合適的液相色譜柱將其完全分離。本實驗嘗試了3種柱效較高的快速分離色譜柱：A柱為Agilent Poroshell 120 EC C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)，B柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，C柱為Waters X-Bridge BEH Phenyl(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)。實驗發(fā)現(xiàn)，A柱可有效分離雙酚類化合物，但對烷基酚類化合物無保留。B柱可分離部分烷基酚類化合物，但對雙酚類化合物的保留較差。C柱可以同時有效分離雙酚類及烷基酚類化合物，且峰形最優(yōu)(如圖1所示)。因此，實驗選擇Waters X-Bridge BEH Phenyl(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)為最佳色譜柱。

圖1 9種目標分析物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 9 target analytes the number denoted was the same as that in Table 1

2.1.2 流動相的選擇由于酚類化合物多在ESI-模式下離子化，而甲醇相比于乙腈具有更低的表面張力，有利于電噴霧液滴源內(nèi)溶劑揮發(fā)，提高靈敏度。本實驗以甲醇為有機相，考察了0.1%氨水、1%氨水、5 mmol/L乙酸銨、純水作為水相的響應，發(fā)現(xiàn)前三者均能夠提高離子對響應。但隨著氨水濃度的增加，雙酚F出現(xiàn)色譜峰拖尾的情況。綜合考慮峰形與離子對響應，選用0.1%氨水和甲醇作為最佳流動相體系。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

根據(jù)目標化合物的極性，本實驗考察了1%氨水甲醇、1%氨水乙腈、乙腈-1%氨水(4∶1，體積比)、乙腈-1%氨水(1∶1，體積比)4種溶劑對化妝品基質(zhì)的提取效果。結(jié)果表明，粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類4種基質(zhì)的化妝品均能均勻分散在4種溶劑中，但使用乙腈-1%氨水(1∶1)提取時，待測物的回收率僅為67.5%～79.2%。使用1%氨水甲醇提取時，長鏈烷基酚(4-NP B，4-n-NP,4-N-OP)的回收率為63.4%～75.1%。使用1%氨水乙腈提取時，回收率雖能達到91.5%～98.4%，但由于1%氨水乙腈的溶劑效應，易造成峰形拖尾。而選擇乙腈-1%氨水(4∶1)為提取溶劑時，可在確?；厥章?82.2%～99.1%)的同時(見圖2)，保證峰形尖銳對稱、分離度好。故本實驗選擇乙腈-1%氨水(4∶1)對8種待測物進行提取。

圖2 4種提取溶劑對膏霜類樣品中8種待測物的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of 8 analytes in cream samples by four solvents

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系、檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，雙酚A采用內(nèi)標法，其他7種雙酚類及烷基酚類化合物采用外標法對“1.3”配制的系列濃度(0.005～50 ng/mL)標準工作溶液進行測定，以各組分的質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標，雙酚A的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值(其他7種待測物的峰面積)(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。由表2可知，8種內(nèi)分泌干擾物均在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)(r)大于0.997。

表2 8種目標分析物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ)of 8 target analytes

選取粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類陰性樣品，各稱取1.0 g，添加混合標準儲備溶液適量，按本方法進行前處理并測定。分別以信噪比(S/N)為3和10時進行計算，得到方法的檢出限(LOD)為0.001 25～0.025 mg/kg，定量下限(LOQ)為0.005～0.05 mg/kg(見表2)。其中，本方法對雙酚A的檢出限(0.005 mg/kg)低于現(xiàn)有國標方法GB/T 30939-2014的檢出限(0.025 mg/kg)[27]。

2.3.2 加標回收率與相對標準偏差取粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類陰性樣品各1.0 g，平行6份，分別加入不同體積的混合標準儲備溶液，按照本方法進行前處理并測定，方法的加標回收率和相對標準偏差(RSD)見表3。由表3可知，8種內(nèi)分泌干擾物的回收率為75.1%～107%，RSD(n=6)為0.1%～1.6%，表明本方法的準確度和精密度較高。

表3 回收率與重復性實驗結(jié)果Table 3 Results of spiked recovery and repeatability test

2.4 實際樣品的測定

應用本方法分別對從市場收集的不同場地、不同品牌的61批染發(fā)類樣品進行測定，其中雙酚A檢出5批次，含量為0.017～0.475 mg/kg；支鏈4-壬基苯酚檢出14批次，含量為0.020～1.190 mg/kg；2,4-二叔丁基酚檢出2批次，含量為0.236～0.250 mg/kg。實際樣品檢測結(jié)果表明，有必要進一步加強對染發(fā)類樣品的監(jiān)管力度。

針對陽性樣品，采用國標方法GB/T 30939-2014與本方法進行對比。由于僅雙酚A有國標檢測方法(檢出限0.025 mg/kg)，故僅對雙酚A作方法比較。結(jié)果顯示，以某染發(fā)霜為典型樣品，采用本方法測得雙酚A的含量為0.475 mg/kg，樣品的MRM提取色譜圖如圖3所示，國標方法測得該染發(fā)霜中雙酚A含量為0.465 mg/kg。本方法與國標方法的結(jié)果基本一致。

圖3 陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of a positive sample

3 結(jié) 論

本文建立了UPLC-MS/MS同時測定化妝品中8種雙酚類及烷基酚類化合物的分析方法。該方法使用內(nèi)標法定量，樣品前處理簡單、回收率穩(wěn)定、靈敏度高，適用于多種化妝品基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的定性定量分析。該方法的建立進一步拓展了雙酚A等內(nèi)分泌干擾物的分析技術(shù)，可為化妝品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。