吳冬雪，劉淑瑩,2，陳思鍵，趙幻希，修 洋*，王淑敏

(1.長春中醫(yī)藥大學 吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022；3.長春中醫(yī)藥大學 藥學院，吉林 長春 130117)

人參是著名的中草藥之一，其主要化學成分有皂苷、多糖、蛋白質、揮發(fā)油、多肽等[1-3]?，F代醫(yī)學與藥理研究證明，人參皂苷為人參的主要活性成分[4-9]，但人參總皂苷的含量僅占人參干重的4%～5%[10-12]，高效的提取、富集、分離、純化是進一步研究人參皂苷的基礎。近年來，人參皂苷的提取方法發(fā)展迅速，涌現了超聲波輔助提取、微波輔助提取、超高壓萃取、CO2超臨界流體萃取等新方法[13-16]。然而關于中藥復方中人參皂苷快速富集、分離、純化的研究相對較少，目前仍主要采用傳統(tǒng)的柱色譜法、液-液萃取法等[17]。這些方法雖然有效，但溶劑消耗量大、耗時長、易污染環(huán)境。高效液相色譜-質譜等高靈敏分析技術在一定程度上緩解了對樣品前處理的需求。但分析中藥復方口服液等復雜體系中的微量成分時，大量的基質易產生基質效應、污染離子源，堵塞毛細管和色譜柱，不適于高靈敏儀器的高通量直接分析。因此，建立有效富集、分離、純化的前處理方法仍然是中藥分析領域的研究熱點。

固相萃取(SPE)技術具有操作簡便、回收率高、溶劑消耗量小等優(yōu)點[13,18-19]，是分析復雜體系中待測物的常用前處理方法。吸附劑是SPE技術的關鍵，直接影響富集、分離、純化的效果[20]。無機多孔材料通常具有獨特的孔道結構、較高的孔體積和比表面積。在有機合成和石油化工等領域，無機多孔材料已作為吸附劑顯示出良好的應用前景[21-23]。以無機多孔材料為吸附劑的SPE技術也被用于食品、環(huán)境樣品的富集和凈化研究[24-26]。Wu等[27]利用多壁碳納米管(MWCNTs)富集水中多環(huán)芳烴類化合物(PAHs)，氣相色譜-質譜分析結果顯示MWCNTs可以有效凈化水中PAHs。然而，利用無機多孔材料分離純化中藥復方有效成分的研究相對較少。一方面是因為中藥復方組成復雜，吸附劑需對待測組分有較高的選擇性。另一方面是因為檢測中藥復方中的微量有效成分時，分析方法需有良好的檢出限和回收率。本文通過考察多種無機多孔材料對人參皂苷的吸附活性，建立了一種快速富集、分離中藥復方益氣養(yǎng)血口服液中人參皂苷的SPE方法，并利用高效液相色譜-三重四極桿質譜(HPLC-QqQ/MS)分析了Re、Rg1、Rb1、Ro 4種主要人參皂苷的含量，為中藥復方中微量有效成分的快速分離、檢測提供了研究基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Ro標準品(純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、正丁醇、丙酮、乙醇、氯仿(分析純，北京化工廠)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國Thermo Scientific公司)；SAPO-11、SAPO-34、SBA-15、ZSM-5、Y型分子篩(純度≥97.0%，先豐納米材料有限公司)；MWCNTs(純度≥97.0%，深圳納米港有限公司)；水系和有機系針式過濾器(0.22 μm，天津津騰實驗設備有限公司)；超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)由Milli-Q純水機(美國Merck Millipore公司)制備；益氣養(yǎng)血口服液(吉林省銀諾克藥業(yè)有限公司，批號：20181204)。

高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(Ultimate 3000-TSQ Endura)、Thermo Syncronis C18色譜柱(2.10 mm×100 mm×1.70 μm，均購于美國Thermo Scientific公司)；KM-5200DE型超聲清洗機(江蘇昆山美美超聲儀器有限公司)；12孔SPE裝置、SPE柱(6.00 mL，天津博納艾杰爾公司)；A-1000S型真空泵、MG-2200型氮吹儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1 高效液相色譜條件色譜柱：Thermo Syncronis C18(2.10 mm×100 mm×1.70 μm)；流動相：0.10%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速：0.20 mL/min；進樣量：1.00 μL；柱溫：35.0 ℃。梯度洗脫：0～8 min,25%～30%B;8～13 min,30%～36%B;13～20 min,36%～48%B;20～32 min,48%～70%B;32～34 min,70%～90%B;34～35 min,90%B;35～37 min,90%～25%B;37～40 min,25%B。

1.2.2 質譜條件電噴霧電離源(ESI)，負離子掃描模式，離子源毛細管溫度：325 ℃；鞘氣壓力：241 kPa；輔助氣流速：3.30 L/min；吹掃氣流速：1.00 L/min；毛細管電壓：-2 500 V；采集范圍：m/z100～2 000。多反應監(jiān)測(MRM)模式定性與定量分析人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Ro的離子對信息及碰撞能量如表1所示。

表1 4種人參皂苷的離子對信息及碰撞能量Table 1 The ion-pairs and collision energies of four ginsenosides

1.3 實驗方法

1.3.1 人參皂苷儲備溶液的配制準確稱量人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Ro標準品，用甲醇(色譜純)分別配制質量濃度為1.00×103μg/mL的單一標準儲備液。將儲備液分別稀釋至100 μg/mL，用于優(yōu)化人參皂苷的離子對信息。將儲備液按比例混合后稀釋至10.0、80.0、100、200、300、500、800 μg/mL，用于建立人參皂苷定量分析的標準曲線。

1.3.2 無機多孔材料分離人參皂苷吸附：取50.0 mg無機多孔材料置于SPE柱中，加入30%甲醇(色譜純)溶液，充分浸沒后打開真空泵，使溶液完全流出SPE柱，再加入5.00 mL人參皂苷標準溶液，靜置吸附一段時間后打開真空泵，使溶液完全流出SPE柱。收集流出液，以甲醇(色譜純)定容，過0.22 μm有機系針式過濾器，HPLC-QqQ/MS分析人參皂苷含量，并計算吸附率。

脫附：取2.00 mL洗脫溶劑加至上述已吸附人參皂苷的多孔材料中，靜置一段時間后打開真空泵，使洗脫溶劑流出SPE柱。洗脫液氮吹至干后用甲醇(色譜純)定容，過0.22 μm有機系針式過濾器，HPLC-QqQ/MS分析人參皂苷含量，并計算回收率。

1.3.3 MWCNTs分離益氣養(yǎng)血口服液中的人參皂苷吸附：取50.0 mg MWCNTs置于SPE柱中，以30%甲醇活化，加入1.00 mL益氣養(yǎng)血口服液，靜置3 min后打開真空泵，收集流出液，以甲醇(色譜純)定容，過0.22 μm水系針式過濾器，HPLC-QqQ/MS分析人參皂苷含量，并計算吸附率。

脫附：取2.00 mL正丁醇加至吸附人參皂苷的MWCNTs中，靜置3 min后打開真空泵，收集流出液，氮吹至干后，以甲醇(色譜純)定容，過0.22 μm有機系濾膜，HPLC-QqQ/MS分析人參皂苷含量，并計算回收率。

1.3.4 吸附率與回收率的計算多孔材料分離人參皂苷的吸附率(Ar)和回收率(Re)計算公式如下：Ar=(c0-ca)/c0×100%；Re=cd/c0×100%。式中：c0(μg/mL)為人參皂苷吸附溶液的初始質量濃度；ca(μg/mL)為達到吸附平衡后吸附溶液中人參皂苷的質量濃度；cd(μg/mL)為達到脫附平衡后脫附溶液中人參皂苷的質量濃度。

1.4 方法學驗證

利用HPLC-QqQ/MS的MRM模式定量分析人參皂苷。以“1.3.1”配制的7個不同質量濃度的人參皂苷標準溶液的色譜峰面積(y)對人參皂苷質量濃度(x)作圖，得到4種人參皂苷的標準曲線方程以及線性范圍。以MWCNTs能夠分離并被HPLC-QqQ/MS檢測(S/N≥3)的人參皂苷最低質量濃度為檢出限。通過加標回收實驗評價方法的準確度：在益氣養(yǎng)血口服液中加入100%含量的4種人參皂苷標準品，加標前人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Ro的質量濃度分別為26.8、23.6、35.4、12.8 μg/mL，利用MWCNTs富集、分離后，HPLC-QqQ/MS進行檢測并計算回收率。所有實驗均平行3次，結果取平均值并計算相對標準偏差(RSD)。

2 結果與討論

2.1 SPE吸附劑的選擇

人參皂苷根據皂苷元結構分為原人參二醇(PPD)型、原人參三醇(PPT)型、齊墩果酸(OA)型。種植人參中含量較高的人參皂苷為PPD型Rb1、PPT型Re和Rg1、OA型Ro，含量可達到人參總皂苷的70.0%以上[28]。因此，選擇這4種人參皂苷考察6種常見的硅基、碳基、硅鋁和磷酸硅鋁構成的無機多孔材料(MWCNTs、SAPO-34、SAPO-11、ZSM-5、Y型分子篩、SBA-15)對人參皂苷的吸附活性(見圖1)。

圖1 6種無機多孔材料對人參皂苷的吸附率Fig.1 Adsorption rates of six kinds of inorganic porous materials on ginsenoside

結果顯示，SAPO-34對4種人參皂苷的吸附率均不足30.0%，這是由于其孔徑約為0.43 nm，較小的孔道尺寸不利于人參皂苷分子的吸附。同樣為磷酸硅鋁分子篩的SAPO-11的孔徑約為0.60 nm，略大于SAPO-34，因此其吸附人參皂苷的能力略高于SAPO-34，尤其對Ro的吸附率顯著提升，表現出選擇性吸附OA型皂苷的潛力。硅鋁分子篩Y和ZSM-5對Re、Rg1、Rb1的吸附率與SAPO-11相近，但對Ro的吸附率明顯低于SAPO-11。由于Y型分子篩有孔徑更大的超籠結構，因此對PPD和PPT型皂苷的吸附能力總體高于SAPO-34、SAPO-11、ZSM-5。SBA-15的介孔孔道使其對人參皂苷的吸附活性更高，且更易于吸附PPD型皂苷，對Rb1的吸附率達到80.0%以上，但對PPT型皂苷的吸附率相對較低。

而MWCNTs的吸附性能明顯高于其他5種多孔材料，對4種人參皂苷的吸附率均達到90.0%以上。其中，對Ro的吸附率略高于其他皂苷，對Rg1的吸附率最低，但仍達到90.0%以上。MWCNTs是具有一維孔道的納米材料，其表面高度離域的大π鍵易與人參皂苷的四環(huán)三萜結構和烯烴鏈形成非共價相互作用，可將人參皂苷吸附于管壁表面或孔道內部，從而表現出更好的吸附活性。上述結果表明，無機多孔材料對人參皂苷的吸附活性隨孔徑的增加有一定提高，但孔徑尺寸并非決定因素。吸附劑的元素組成和電子構型也是影響吸附活性的重要因素。良好的吸附活性是快速富集、分離待測物的前提。因此本實驗選擇MWCNTs作為SPE吸附劑。

2.2 分離條件的優(yōu)化

2.2.1 MWCNTs對人參皂苷的吸附容量首先計算MWCNTs對不同濃度人參皂苷的吸附率，通過擬合曲線計算得到MWCNTs對人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Ro的吸附容量分別為31.5、30.1、32.8、34.4 μg/mg?？梢?，MWCNTs對4種人參皂苷有較高的吸附容量，且不同類型皂苷的吸附容量差異較小，對OA型皂苷的吸附容量略高于PPD和PPT型皂苷。這是因為Ro的2個羰基基團有利于吸收MWCNTs的離域電子，增強了與MWCNTs的非共價相互作用。

2.2.2 MWCNTs用量的影響考察了MWCNTs用量對30 μg/mL人參皂苷溶液吸附率的影響，由圖2可知，當MWCNTs用量為10.0 mg時，其對不同類型人參皂苷的吸附率差異較大。隨著MWCNTs用量的增加，4種人參皂苷的吸附率逐漸提高，且對不同類型皂苷的吸附率差異明顯降低。當MWCNTs用量高于50.0 mg時，4種人參皂苷的吸附率變化不明顯，表明已趨于吸附平衡。最終確定MWCNTs的用量為50.0 mg。

圖2 MWCNTs用量對人參皂苷吸附率的影響Fig.2 Effects of MWCNTs dosage on the adsorption rates of ginsenosides

2.2.3 吸附溶劑的影響吸附溶劑直接影響人參皂苷在吸附溶液和吸附劑中的分配比例，因此考察了吸附溶劑甲醇體積分數對人參皂苷吸附率的影響(見圖3)。結果顯示，人參皂苷的吸附率隨甲醇體積分數的增加先升高再降低，其中30%甲醇溶液對4種人參皂苷的吸附率最高，100%甲醇不利于吸附PPT型人參皂苷。這是由于MWCNTs具有疏水的表面結構，降低吸附溶劑的極性有利于人參皂苷與吸附劑的充分接觸，提高吸附率。PPT型人參皂苷的極性通常強于PPD和OA型皂苷。當甲醇體積分數過大時，PPT型皂苷溶解度的降低程度高于其他皂苷，影響了其與MWCNTs的接觸幾率，進而導致吸附率降低。Ro結構中含有強極性的羧基基團和弱極性的OA型皂苷元，具有一定的雙親性質，因此甲醇體積分數對Ro吸附率的影響并不明顯。實驗選擇30%甲醇溶液作為吸附溶劑。

圖3 甲醇體積分數對人參皂苷吸附率的影響Fig.3 Effects of methanol percentage on the adsorption rates of ginsenosides

2.2.4 脫附溶劑類型的影響分別考察了正丁醇、水飽和正丁醇、丙酮、乙腈、50%乙腈、氯仿、50%甲醇(分析純)、乙醇、70%乙醇、40%乙醇10種脫附溶劑對人參皂苷回收率的影響，結果顯示，以正丁醇為脫附溶劑時，4種人參皂苷的回收率最高，均在90.0%以上，且不同類型皂苷的回收率相近。以水飽和正丁醇脫附時，PPD和PPT型皂苷的回收率可達到75.0%～80.0%，但OA型皂苷Ro的回收率不高于20.0%。乙醇和70%乙醇對PPT型皂苷的回收率同樣為75.0%～80.0%，且明顯高于PPD和OA型皂苷，表現出選擇性脫附PPT型皂苷的能力。其他6種脫附溶劑的脫附能力較差，回收率均未達到60.0%。值得注意的是，除正丁醇外的其他溶劑對OA型皂苷Ro的脫附率均較低，且MWCNTs對Ro的吸附率高于PPT和PPD型皂苷。因此，可以推斷MWCNTs與OA型皂苷的非共價相互作用強于PPT和PPD型皂苷，而正丁醇與OA型皂苷的作用力更強，足以將其從MWCNTs中洗脫。因此選擇正丁醇作為脫附溶劑。

2.2.5 吸附與脫附平衡時間吸附和脫附平衡的時間是考察吸附劑活性的重要指標，直接影響富集、分離方法的時間成本。MWCNTs對4種人參皂苷的吸附率隨時間的變化如圖4A所示，吸附30 s時吸附率已達95.0%以上，60 s時吸附率達到98.6%以上，隨后逐漸達到平衡。進一步利用正丁醇脫附人參皂苷，回收率隨脫附時間的變化如圖4B所示，脫附60 s時即達到脫附平衡，4種人參皂苷的回收率均超過95.0%，說明正丁醇是快速洗脫人參皂苷的理想溶劑。結果表明，MWCNTs有較高的人參皂苷吸附容量，可在短時間內達到吸附和脫附平衡，吸附和脫附平衡時間分別為2 min和1 min。

圖4 人參皂苷吸附(A)和脫附(B)的平衡時間Fig.4 Adsorption(A) and desorption(B) equilibrium times of ginsenosides

2.2.6 脫附溶劑體積的影響以正丁醇為脫附溶劑，考察了脫附溶劑體積對人參皂苷回收率的影響。結果表明，對50.0 mg吸附人參皂苷至飽和的MWCNTs進行洗脫，當脫附時間一定時，1.00 mL正丁醇能夠回收96.8%以上的人參皂苷，2.00 mL正丁醇即可達到脫附平衡。由于正丁醇對4種人參皂苷均有較高的溶解度，因此少量的正丁醇即可有效洗脫人參皂苷，得到較高回收率的同時也降低了溶劑用量。最終確定脫附溶劑體積為2.00 mL。

2.3 益氣養(yǎng)血口服液中人參皂苷的快速分離分析

2.3.1 方法學驗證結果按照“1.4”進行方法學驗證，Re、Rg1、Rb1、Ro的線性關系、檢出限、回收率及RSD如表2所示。結果表明，4種人參皂苷在10.0～800 μg/mL范圍內線性良好，相關系數(r2)均不低于0.996，檢出限為0.01～0.05 μg/mL，平均回收率為90.5%～99.7%，RSD為2.2%～4.9%，表明建立的方法可以快速、準確地分離分析微量的人參皂苷。

表2 4種人參皂苷的線性關系、檢出限、回收率及相對標準偏差Table 2 Linear relations,limits of detection,recoveries and relative standard deviations of four ginsenosides

2.3.2 MWCNTs分離益氣養(yǎng)血口服液中的人參皂苷益氣養(yǎng)血口服液由人參、黃芪、麥冬等14種中藥組成，人參皂苷作為其主要的活性成分含量較低。采用本方法對未經MWCNTs吸附的益氣養(yǎng)血口服液中人參皂苷進行測定，如圖5A所示，糖類等基質對檢測產生明顯干擾。利用基于MWCNTs的SPE方法快速富集、分離口服液中的皂苷類成分后，檢測結果如圖5B和C所示。經MWCNTs吸附后的口服液譜圖中無皂苷類成分的色譜峰，主要為強極性的糖類成分，脫附溶液的譜圖中主要為人參皂苷的色譜峰，表明建立的方法能夠選擇性吸附人參皂苷，且對糖類等其他成分無明顯吸附作用，適用于口服液中人參皂苷的快速富集、分離。進一步利用HPLC-QqQ/MS測定脫附溶液中的人參皂苷，計算得到益氣養(yǎng)血口服液中Re、Rg1、Rb1、Ro的質量濃度分別為(27.1±0.01)、(23.4±0.02)、(35.9±0.01)、(13.0±0.02) μg/mL。

圖5 益氣養(yǎng)血口服液(A)、MWCNTs吸附后的口服液(B)、脫附的人參皂苷(C)的基峰強度圖Fig.5 Base peak intensity chromatograms of Yiqiyangxue oral liquid(A),oral liquid after being adsorbed by MWCNTs(B) and desorbed ginsenosides(C)

3 結 論

本文考察了6種無機多孔材料作為SPE吸附劑富集、分離人參皂苷的活性，與其他5種材料相比，MWCNTs具有更高的吸附容量，可在2 min內分別達到吸附和脫附平衡，且吸附率和回收率分別達到98.6%和96.8%以上。并結合HPLC-QqQ/MS建立了快速分離檢測益氣養(yǎng)血口服液中Re、Rg1、Rb1和Ro 4種人參皂苷的方法。建立的方法準確度高、檢出限低、耗時短、操作簡便、節(jié)省溶劑，可有效降低益氣養(yǎng)血口服液的基質干擾，提高人參皂苷檢測的準確度，具有準確分析復雜體系中微量人參皂苷的潛力。