劉雯靜，鐘榕榕，翁文婷，謝曉蘭

(泉州師范學院化工與材料學院,福建 泉州 362000)

熒光分析法作為一種操作簡便、高靈敏度的光譜分析方法，在生物化學、醫(yī)學和化工領域廣泛應用。發(fā)展新型熒光試劑探針是發(fā)展熒光分析的重要途徑，也是研究熒光體系的內(nèi)在規(guī)律的基礎[1]。通常能發(fā)熒光的熒光體多為有機芳香族化合物[2]。具有自發(fā)熒光的有機化合物因其熒光譜帶寬闊、易相互重疊而不易識別。合適新型熒光試劑對于提高待測物質(zhì)檢測檢出限和靈敏度有很大幫助，因而開發(fā)一種靈敏、專一性、高效的熒光探針具有很重要的意義。

萘胺是一種很好的熒光基團，其結(jié)構(gòu)中的芳伯氨基有利于發(fā)生重氮化，有利于偶合加成反應。Sun課題組[3]通過將萘胺和羅丹明合成制備比率型的熒光探針，實現(xiàn)了對鈀離子的靈敏檢測。Ghosh等[4]合成多種萘胺衍生物作為Fe(Ⅲ)的高靈敏檢測的新型熒光探針。同時，其課題組[5]制備的萘胺衍生結(jié)構(gòu)熒光探針，可以實現(xiàn)水介質(zhì)中的Hg(Ⅱ)，F(xiàn)e(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的同時檢測，有效應用在活細胞和生物邏輯門的研究中。2-巰基苯并噻唑是一種化工中間體，具有較強的吸電子或給電子能力，但是其雜環(huán)結(jié)構(gòu)較簡單，熒光性能不明顯。王金金等[6]以苯并噻唑為熒光團結(jié)合氰基乙酸乙酯合成了能夠雙重檢測水合肼和亞硫酸鹽的熒光探針。古雯蕾等[7]將2-肼基苯并噻唑與2-氰基苯甲醛縮合，得到一種在水體系中能高選擇性、高靈敏度地識別Ag+的席夫堿型熒光化合物。

若能在苯胺結(jié)構(gòu)中引入苯并噻唑基團后形成重氮化結(jié)構(gòu)的熒光試劑，可形成較大的剛性平面結(jié)構(gòu)從而提高熒光性能。形成的重氮氨基類試劑又具有很好的配位基團，是金屬離子的優(yōu)良顯色劑，該類試劑可具有高靈敏度和選擇性的特性[8-10]。

本文以1-萘胺和2-巰基苯并噻唑為原料，合成一種新型偶氮型熒光試劑8-萘重氮氨基-2-硫代苯并噻唑(NADTBT)。采用高效液相色譜法、紅外光譜法及質(zhì)譜法對其結(jié)構(gòu)進行表征，并用熒光光譜法測定其熒光特性，討論其和金屬離子的作用機理。發(fā)現(xiàn)其和多種金屬離子均有作用導致熒光強度發(fā)生變化，對銅離子響應最為靈敏。在(1.00～9.00)×10-6mol/L范圍內(nèi)，銅離子濃度與熒光猝滅程度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F0/F=1.517 1×106CCu2++1.891 8，相關(guān)系數(shù)r=0.995 5。因此，合成的NADTBT可作為一種全新的銅離子檢測的熒光分析探針。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

2-巰基苯并噻唑(C7H5NS2, MBT)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；1-萘胺(C10H9N, NA)分析純，上海試劑三廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，使用水為二次蒸餾水。

AVAT-360傅里葉紅外光譜儀，美國尼高利有限公司；Cary/Eclipse熒光光度計，東南化學儀器有限公司；Agilent 1100LC高效液相色譜儀，美國Agilent有限公司：色譜柱Zorbax eclipse XDB C18柱( 150 mm×4.6 mm)；Agilent-5973N氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；XMTD-822真空干燥箱，廈門市寶能科技有限公司。

1.2 新型熒光試劑的合成

準確稱取0.213 3 g 1-萘胺溶解于1.0 mL甲酸、3.0 mL水和1.0 mL鹽酸的混合溶劑中，在0～5 ℃冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入2.0 mL濃度為1mol/L的亞硝酸鈉水溶液，反應30 min為A溶液，使其重氮化完全。另外稱取0.1671 g的2-巰基苯并噻唑溶于20 mL乙醇中為B溶液。在0～5 ℃條件下，將B溶液邊攪拌邊加入A溶液。并用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值為7～8，恒溫反應2 h后，放入冰箱中靜置過夜，析出晶體。減壓抽濾，先后用水和乙醇多次洗滌，并放入真空干燥箱中40 ℃烘干。干燥后的粗產(chǎn)品用體積分數(shù)為95%的乙醇重結(jié)晶2次得純品, 并計算產(chǎn)率[11]。合成路線如圖1所示。

圖1 NADTBT的合成路線

1.3 熒光光譜測定

準確稱取NADTBT固體粉末，配制不同溶劑和不同pH值的1.0×10-4mol/L NADTBT-乙醇溶液，在熒光光譜儀上進行熒光光譜掃描，在狹縫比為5.0 nm/5.0 nm，λex=225 nm處進行熒光光譜的測定，光電倍增管電壓為400 V，掃描速度為1 200 nm/min的條件進行測定。討論不同溶劑及pH值溶液環(huán)境對NADTBT熒光性能的影響。

準確移取1 mL 5.0×10-5mol/L NADTBT溶液，加入的不同量的金屬離子和5 mL pH=6.86的混合磷酸鹽緩沖溶液，以水定容至10 mL，混勻后進行熒光光譜的掃描。考察金屬離子加入前后對NADTBT溶液的熒光光譜強度變化。

采用相對法對NADTBT的PLQY進行計算，以硫酸喹啉的0.1 mol/L的硫酸溶液(Ys=0.54)作為參比物質(zhì)。采用以下計算公式進行計算[12]：

式中：Au、As—為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)在該激發(fā)波長的入射光的吸光度；Fu、Fs—為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強度；Yu、Ys—待測物質(zhì)和參比標準物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率。

為避免溶液的自吸收效應，應保證溶液的紫外吸光度值應低于0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成反應條件的優(yōu)化

稱取摩爾比約為1∶2的2-巰基苯并噻唑和1-萘胺，在其他反應條件相同的情況下，考察反應時間為對產(chǎn)量的影響。實驗結(jié)果表明，隨著反應時間的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率逐漸增大。當反應時間延長至2 h以上，合成產(chǎn)率變化不大，為了提高效率，選擇其最佳反應時間為2 h。

稱取摩爾配比為1∶1、2∶3、1∶2、1∶3的2-巰基苯并噻唑和1-萘胺共4組，在其他反應條件相同的情況下，考察不同反應物配比對產(chǎn)量的影響。實驗數(shù)據(jù)表示，2-巰基苯并噻唑的配比過高或者過低都會使產(chǎn)率降低，當摩爾比為2∶3時，產(chǎn)率達到最高。

2.2 NADTBT的組成及物理性質(zhì)

按最優(yōu)化條件制備NADTBT，提純后產(chǎn)物呈現(xiàn)紅褐色粉末狀固體；產(chǎn)率為40.7%；產(chǎn)物在室溫下易吸潮；不溶于堿，微溶于水和酸，可溶于乙醇。

2.3 結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紅外光譜

取烘干處理后的1-萘胺、2-巰基苯并噻唑和NADTBT固體粉末，制備KBr壓片，于紅外譜儀上測定化合物在400～4 000 cm-1處的紅外光譜圖。

如圖2所示，由NADTBT譜圖可知在波數(shù)為3 429 cm-1處有一明顯的N—H吸收峰，不同于兩種反應物，而且氨基峰比萘胺的加寬很多，這可能是由形成環(huán)狀—NH—基團造成；1 559，1 468，1 428 cm-1處有苯環(huán)骨架吸收峰；1 622 cm-1處為—N=N—吸收峰；1 005 cm-1處為Ar-N吸收峰，進一步驗證合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

圖2 1-萘胺、2-巰基苯并噻唑和NADTBT的紅外光譜

2.3.2 質(zhì)譜表征

配制1.0×10-5mol/L NADTBT-乙醇溶液，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行質(zhì)譜的測定。其質(zhì)譜圖分別出現(xiàn)m/z143、115、89、71、58等多個離子峰。其中m/z143可能是萘胺在電子轟擊質(zhì)譜得到樣品分子瞬間高溫高度碎裂后的分子離子碎片，推斷可能裂解結(jié)構(gòu)如圖3所示，這符合質(zhì)譜的氮律規(guī)則。m/z115也具有較大質(zhì)量數(shù)，這可能是因為MBT分子中的苯環(huán)連接有2個雜原子N和S，不能有效的離子化，而導致五元環(huán)開裂，失去兩個電子形成的二價離子碎片，同類的重氮萘胺的二價離子碎片剛好符合m/z71，形成這類的二價離子是雜環(huán)、芳環(huán)及高度不飽和化合物的特征。

圖3 NADTBT的分子結(jié)構(gòu)的可能裂解過程

2.3.3 高效液相色譜表征

配制10 μmol/L的2-巰基苯并噻唑溶液、1-萘胺和NADTBT乙醇溶液，分別進行高效液相色譜儀掃描。由圖4可知，在相同流速和進樣量的條件下，測得NADTBT保留時間為7.655 min，明顯不同于原料2-巰基苯并噻唑和1-萘胺的保留時間為9.695 min和2.135 min。由此可以定性說明所制備的NADTBT為一不同于原料的全新化學物質(zhì)。

圖4 2-巰基苯并噻唑、1-萘胺和NADTBT的高效液相色譜

2.3.4 熒光光譜表征

按實驗方法測試1-萘胺、2-巰基苯并噻唑和NADTBT的熒光光譜，實驗結(jié)果如圖5所示。NADTBT在225 nm激發(fā)波長下于366 nm處有一明顯熒光峰；而相同條件下2-巰基苯并噻唑結(jié)構(gòu)并未有明顯熒光信號，1-萘胺的熒光發(fā)射峰在428 nm處，峰型特征明顯區(qū)別于產(chǎn)物。由此推測，制得的NADTBT是通過N=N基團連接一個萘環(huán)和一個巰基苯并噻唑環(huán)，形成一個大π-π*共軛體系，具有不同于萘環(huán)的熒光特性，為一種新熒光物質(zhì)。采用相對硫酸喹啉熒光法對NADTBT的PLQY進行計算，測得相對熒光量子產(chǎn)率為5.82%。

圖5 NADTBT溶液與反應物的熒光光譜對比圖

2.4 熒光強度影響因素的探討

2.4.1 溶劑對NADTBT溶液的影響

按實驗方法配制不同溶劑的NADTBT溶液，于熒光分光光度計上測繪熒光光譜。結(jié)果如圖6所示。

圖6 (a)不同溶劑的NADTBT溶液的熒光光譜和(b)熒光強度變化趨勢

NADTBT的乙醇溶液的熒光強度最高，在其他溶劑環(huán)境中NADTBT的發(fā)光性能較弱。所以最終選擇乙醇為體系研究的最佳溶劑。

2.4.2 pH值的影響

按實驗方法，考察乙醇溶液pH值對NADTBT熒光性能的影響。實驗結(jié)果如圖7所示，NADTBT的熒光強度隨著pH值的增大而逐漸增強，但當pH=13時，熒光強度不增反而急劇下降。這可能是因為強堿性條件下NADTBT 的N=N結(jié)構(gòu)發(fā)生水解導致的。

圖7 不同pH值環(huán)境中NADTBT的(a)熒光光譜和(b)熒光強度變化趨勢圖

3 熒光探針NADTBT的應用研究

3.1 NADTBT對不同金屬離子的響應

在以上確定的最佳實驗條件下，按實驗方法加入不同濃度的過渡金屬離子，考察加入金屬離子前后NADTBT的熒光光譜變化，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同濃度金屬離子對NADTBT試液的熒光強度猝滅趨勢

在一定的濃度范圍內(nèi)，對NADTBT的熒光猝滅程度Cu2+>Pb2+>Cd2+>Co2+，Zn2+反而是增強溶液的熒光強度。這樣的實驗結(jié)果符合文獻中提到的配合物的熒光發(fā)射特征，可推測金屬離子與NADTBT之間形成了配位化合物[2]。

3.2 對銅離子的響應曲線

按實驗方法，加入不同濃度的銅離子溶液，進行熒光光譜測定。實驗結(jié)果如圖9所示，在(1.00～9.00)×10-6mol/L范圍內(nèi)，熒光猝滅程度與加入的銅離子濃度呈良好的線性關(guān)系，測定的線性方程為F0/F=1.517 1×106CCu2++1.891 8，相關(guān)系數(shù)R=0.995 5。參照實驗方法，平行測定不加入銅離子的空白溶液的10次熒光光譜值，求出標準偏差SD=0.161 01，檢出限QL=3SD/K，K為標準曲線的斜率，可算出檢出限QL=3.18×10-7mol/L。

圖9 NADTBT溶液的熒光強度隨銅離子濃度的線性變化曲線

3.3 共存離子的干擾

4 結(jié) 論

在0～5 ℃的恒溫反應條件下，將1-萘胺和NaNO2溶液進行重氮化反應0.5 h后，將重氮化鹽溶液按n(重氮化鹽)∶n(2-巰基苯并噻唑)=2∶3滴加入2-巰基苯并噻唑乙醇溶液中，在pH值為7～8條件下反應時間為2 h，制得新型熒光探針試劑NADTBT。該熒光物質(zhì)溶于乙醇，具有一定的熒光特性，最佳激發(fā)/發(fā)射波長為225 nm/366 nm，熒光量子產(chǎn)率為5.82%。多種金屬離子可與NADTBT結(jié)構(gòu)中的多個氮原子形成配位化合物，導致NADTBT熒光信號發(fā)生猝滅。對銅離子響應最為靈敏，在(1.00～9.00)×10-6mol/L范圍內(nèi)，銅離子濃度與熒光猝滅程度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F0/F=1.517 1×106CCu2++ 1.891 8，相關(guān)系數(shù)r=0.995 5。