李王強(qiáng) 樊哲新 劉月 李寶坤 李開雄

（石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子056400）

發(fā)酵乳制品中有多種微生物參與發(fā)酵過程，其中酵母菌的作用不可忽視，其利用價(jià)值也越來越高。Njage 等[1]從干旱、半干旱地區(qū)的發(fā)酵駝乳篩選到21 種酵母菌，通過生理生化特征結(jié)合RFLP、RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)分析，尚未闡明各類酵母在發(fā)酵過程中的作用。陳歷水等[2]從原料乳中篩選到一株抗氧化活性良好的畢赤酵母（Pichia fermentans），用于生產(chǎn)天然抗氧化劑。對酵母菌的分離、鑒定，以及研究其在乳品發(fā)酵過程中的作用，將有助于加快工業(yè)化生產(chǎn)健康發(fā)酵產(chǎn)品。

在分子生物學(xué)中DGGE 電泳技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于樣品中微生物多樣性的研究。1979年Fischer 和Lerman[3]最先提出利用變性梯度凝膠電泳檢測DNA 堿基序列的點(diǎn)突變，理論上可檢測一個(gè)核苷酸序列的差異。1993年，Muyzer等[4]首次將DGGE 電泳技術(shù)應(yīng)用到分子微生物的研究中，證實(shí)該技術(shù)在揭示自然界不同微生物區(qū)系的遺傳多樣性和菌群差異方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。隨著分子生物學(xué)的改進(jìn)與發(fā)展，DGGE 電泳技術(shù)在分析樣品微生物菌群差異和菌群演變方面發(fā)揮了不可替代的作用。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于土壤[5-8]、廢水[9-11]、腸道[12-16]、食品[17-20]等微生物群落多樣性的研究。

牧民自制發(fā)酵駝乳中的酵母菌是經(jīng)過多代自然選擇而優(yōu)化的種群。本文對新疆牧民制作的發(fā)酵駝乳中酵母菌進(jìn)行分離、鑒定、收集、保藏，為新疆特色的地域性微生物提供了保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料

駝乳樣品采自新疆伊犁州國營牧場、巴音傲瓦鄉(xiāng)、伊克烏圖布拉格牧場，精河小海子、精河闊岱管護(hù)站。12 個(gè)發(fā)酵駝乳樣品均由哈薩克族、蒙古族和維吾爾族牧民家庭傳統(tǒng)發(fā)酵而成，無菌采集樣品，4 ℃冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 設(shè)備與儀器

LX-1002 離心機(jī)，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；5417R 高速冷凍離心機(jī)、Eppendorf移液槍，德國Eppendorf 公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；萬分之一電子天平，丹佛儀器（北京）有限公司；DGGE 電泳儀，荷蘭INGENY 公司；TC-512 PCR 擴(kuò)增儀，英國Techne 公司；凝膠成像儀（GelDoc 2000 system Bio-Rad），美國BIO-RAD 公司；DNP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分析樣品中優(yōu)勢酵母菌

1.3.1.1 酵母菌總數(shù)的測定 取10 mL 樣品混勻在90 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的滅菌生理鹽水中，混勻，10 倍梯度稀釋懸浮液。采用平板涂布法，分別吸取0.1 mL 10-2～10-54 個(gè)稀釋度的菌懸液于酸化的YPD 固體平板上，涂布均勻，25 ℃培養(yǎng)48～56 h 后計(jì)數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.1.2 酵母菌的分離、純化及保藏 仔細(xì)觀察計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上酵母菌的菌落形態(tài)，挑選不同特征的單菌落，在酸化的YPD 培養(yǎng)基上劃線分離，25℃恒溫培養(yǎng)48～56 h。反復(fù)劃線純化，直到菌落形態(tài)單一，選擇符合酵母形態(tài)（大小、形狀、顏色等）的菌株再次接種到酸化液體YPD 培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48～56 h，連續(xù)培養(yǎng)3 代。吸取第3 代菌液800 μL 于1.5 mL 離心管中，再加入600 μL 50%的甘油，-80 ℃保藏。

1.3.1.3 酵母菌生理生化試驗(yàn)[21-24]酵母菌分離菌株主要通過菌落特征觀察、糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)、脲素水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2 基于PCR-DGGE 技術(shù)分析樣品中酵母菌多樣性

1.3.2.1 樣品預(yù)處理 提取樣品DNA 前，將三角瓶、槍頭及移液管等高壓滅菌處理。用移液管分別吸取45 mL 無菌駝乳在150 mL 三角瓶中，移液槍移取5 mL 發(fā)酵駝乳樣品到三角瓶中，對應(yīng)樣品編號，充分混勻，在25 ℃下繼續(xù)發(fā)酵24 h，形成二次發(fā)酵乳。所有操作均在無菌操作室進(jìn)行，避免人為及環(huán)境的污染。

1.3.2.2 樣品總DNA 的提取 將上述純化的酵母菌接種于YEPD 液體培養(yǎng)基中置于28 ℃培養(yǎng)36 h 后，去1 mL 活化菌液，12 000 r/min 離心1 min，收集沉淀即為菌體。按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書上的方法操作，然后將所提取的DNA 于-20 ℃保存。

1.3.2.3 26S rDNA D1 區(qū)的PCR 擴(kuò)增 以DNA提取液為模板，蒸餾水為陰性對照，DGGE 擴(kuò)增引物NL1GC 和LS2，二輪擴(kuò)增引物為NL1 和LS2[25]。

PCR 擴(kuò)增體系50 μL：DNA 模板2 μL，引物各2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，36 個(gè)循環(huán) （95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s），72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，穩(wěn)壓90 V，電泳時(shí)間約為20～30 min，檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.2.4 DGGE 指紋圖譜構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[26]及反復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)酵母菌擴(kuò)增片段大小選擇6%丙烯酰胺凝膠，變形梯度定為30%～50%。變性梯度凝膠電泳基本操作和條帶的回收、處理及分析同參考文獻(xiàn)[26]。

表1 酵母菌DGGE 制膠配比Table 1 The ratio of denaturing solution of yeast

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離與鑒定

2.1.1 酵母菌計(jì)數(shù) 新疆不同地區(qū)不同民族牧民家庭采集的發(fā)酵駝乳中酵母菌計(jì)數(shù)結(jié)果及采樣信息如表2所示。

2.1.2 菌落形態(tài)觀察 樣品中分離出35 株酵母菌，菌落特征初步觀察，如表3所示。

2.1.3 菌株生理生化性質(zhì) 分離菌株糖發(fā)酵、碳源同化及氮源同化結(jié)果分別見表4和表5。

通過形態(tài)觀察、測定菌株生理生化特性，結(jié)合查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊》[27]，推斷分離得到的35 株酵母菌在生理特性上歸屬于5 個(gè)屬，結(jié)果為：菌株G1，G2，B2，B8，Y2，Y8，X2，K4 為馬克斯克魯維酵母；G3，G5，G6，G9，B3，B5，B6，B7，Y1，Y4，Y7，Y11，X1，K1，K3 為單胞釀酒酵母；G4，G7，B1，B4，B9，Y3，Y5，Y6，Y10 為林 德納克勒酵母；Y9 和K2 為釀酒酵母；G8 為白地霉酵母。

表2 新疆地區(qū)樣品采集與分離結(jié)果Table 2 Result of isolated strains from samples of Xinjiang

表3 菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果Table 3 Results of colony shape and cellular shape

（續(xù)表3）

表4 酵母菌株糖發(fā)酵試驗(yàn)及生理鑒定結(jié)果Table 4 Results of carbohydrate fermentation and physiological and biochemical properties of yeasts

（續(xù)表4）

表5 分離菌株碳源同化試驗(yàn)及氮源同化試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for identification of isolated yeasts

2.2 PCR-DGGE 技術(shù)分析多樣性

2.2.1 真菌總DNA 的提取及擴(kuò)增 乳制品中微生物組成復(fù)雜，且脂肪含量高，能夠得到目標(biāo)DNA 是后期試驗(yàn)的前提。采用CTAB 法提取樣品總DNA，可以最大限度提取樣品中基因DNA。以NL1 和LS2 為引物，擴(kuò)增酵母菌26S rDNA 基因的D1 區(qū)，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。可看出，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為700 bp左右，是目標(biāo)條帶，符合后期DGGE 試驗(yàn)要求。

2.2.2 DGGE 圖譜結(jié)果 酵母菌26S rDNA 的D1可變區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)變性梯度凝膠電泳技術(shù)分離，由EB 染色后得到了清晰地條帶，如圖2所示。

圖1 PCR 擴(kuò)增的26S rDNA 序列瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR amplification agarose gel electrophoresis of 26S rDNA partial sequence

圖2 DGGE 指紋圖譜及Quantity One 軟件分析結(jié)果圖Fig.2 Profiles of PCR amplified 16S rDNA gene separated by DGGE and analyzed by quantity one software

從圖2a 可以看出，不同發(fā)酵駝乳樣品之間有一些共有條帶，這些共有條帶亮度不盡相同；所有樣品之間沒有公共條帶。結(jié)果表明，不同樣品之間在酵母菌種類存在差異性和共性，在種群豐度上也有一定的區(qū)別。

通過Quantity One 軟件對電泳圖譜中特異性條帶數(shù)量、遷移位置以及相對強(qiáng)度進(jìn)行分析，由圖2b 可知，一共在32 個(gè)位點(diǎn)獲得232 條條帶，不同樣品之間條帶數(shù)量、種類及相對含量有很大差異；所有樣品通過變性梯度電泳分離出的特異性條帶數(shù)目在10～34 之間不等，說明樣品酵母菌群落結(jié)構(gòu)具有多樣性，樣品之間差異性明顯。樣品G1（L12）、B4（L3）和Y10（L9）所形成的泳道條帶亮度很弱，而條帶豐度高，說明該樣品中酵母菌種類多而相對含量較少。

除Y9（L8）樣品外，條帶24 在其它樣品中均有體現(xiàn)；條帶26 在X11（L10）上不出現(xiàn)而在其余樣 品中 出現(xiàn)。條 帶4，5，6，14，15，16，18，21，22，27，28，30 和31 在絕大部分樣品中都會顯現(xiàn)；有些條帶出現(xiàn)在少數(shù)樣品中，如條帶1 只在G2（L1）、B4（L3）、B5（L4）、和B6（L5）樣品中出現(xiàn)；條帶7 只在B6（L5）和Y10（L9）樣品中出現(xiàn)。將DGGE 指紋圖譜中清晰地特異性條帶用無菌手術(shù)刀小心切膠，膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，選擇陽性克隆子測序。將所得序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，申請序列登錄號，利用Blast 程序?qū)π蛄羞M(jìn)行同源性比對、分析，結(jié)果如表6所示。

表6 發(fā)酵駝乳樣品中酵母26S rDNA 基因序列的分析結(jié)果Table 6 Results from 26S rDNA sequences analyze of yeast of samples

將條帶的測序結(jié)果與GenBank 中已有酵母序列Blast 比對，下載同一種屬且有代表性的標(biāo)準(zhǔn)序列，采用MEGA5.0 軟件進(jìn)行UPGMA 算法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值（boot strap）為1 000，結(jié)果如圖3所示。

圖3 DGGE 條帶序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of sequences derived from DGGE bands

2.2.3 樣品中酵母菌群落相似性 利用Quantity One 對膠圖讀取條帶信息，得到模擬條帶分析圖（圖2b），統(tǒng)計(jì)DGGE 圖譜中特異性條帶數(shù)以及各樣品間共有條帶數(shù)目，計(jì)算酵母菌群落之間差異信息，從而得到酵母菌相似性結(jié)果（表7）和基于相似性的聚類分析結(jié)果（圖4）。據(jù)表7看出，所有樣品的酵母菌相似性系數(shù)在21.9%～73.9%范圍之間，說明各樣品間酵母菌的種群結(jié)構(gòu)有較大差異。其中G2 和B6 之間相似性最低，相似性系數(shù)僅為21.9%；而相似性最高的是Y10 和B6，系數(shù)高達(dá)73.9%。

表7 樣品酵母菌相似性分析Table 7 Similarity coefficients of yeast community in samples

圖4 樣品中酵母菌群落結(jié)構(gòu)相似性的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of yeast community structure similarity in samples

據(jù)圖4看出，所有樣品在相似性40%水平上基本分為4 個(gè)類群，可知B4、B6、G1 和Y10 形成一類；Y7、Y8 和Y9 是第二類；G2、G3、B5 和K12構(gòu)成第三類；X11 獨(dú)自一類，不與任何一個(gè)樣品聚為一類，這說明該樣品有較為獨(dú)特的種群結(jié)構(gòu)，與其余樣品的差異較大。來源于蒙古族牧民家庭的3 個(gè)發(fā)酵駝乳樣品G1、G2 和Y7，分別在3 個(gè)類群里面，即使G1 和G2 來源于同一地區(qū)同種民族，相似性也僅為42%左右。采自不同地區(qū)維吾爾族牧民家庭的4 份發(fā)酵駝乳G3、B5、Y8 和Y10，B5和G3 相似性約為42%，Y8 和Y10 相似度小為24.2%。哈薩克牧民家庭的B4 和B6 之間相似性達(dá)到了66%，這可能是因?yàn)椴蓸幽翀鼋咏覛夂颦h(huán)境相近，也有可能是哈薩克牧民在制作發(fā)酵駝乳時(shí)有相似的處理過程（如發(fā)酵容器、發(fā)酵工藝和擠乳習(xí)慣等），導(dǎo)致相似性較高[25]。樣品X11 采自精河小海子地區(qū)，與其余樣品間酵母群落相似度極低，獨(dú)成一類，這有可能與當(dāng)?shù)啬撩癖４嫠崛椤耙印钡奶貏e方式有關(guān)（在鹽處理過的羊胃里保存數(shù)年），發(fā)酵歷史遠(yuǎn)高于其它樣品，這些原因造成酵母菌群的特殊性。B6 和Y10 相似性最高，達(dá)到73.9，二者采樣地區(qū)不同，民族不同。總體來說，酵母菌群相似性與采樣地區(qū)和民族之間的關(guān)系不是很大，發(fā)酵方式對其影響也不是很大。

2.2.4 多樣性指標(biāo)分析 變性梯度凝膠電泳得到的譜圖中，條帶數(shù)量是樣品中酵母種類的一個(gè)表征，通過條帶的相對亮度及遷移位置可計(jì)算多樣性指數(shù)。根據(jù)DGGE 指紋圖譜中條帶的相對強(qiáng)度，分析樣品中的酵母菌多樣性指數(shù)（H）和豐富度（S）指標(biāo)，分別見圖5和圖6。

由圖5可知，不同樣品之間酵母菌H 值有很大差異。Y10 樣品的H 值最高，為3.41，表明其酵母菌種群多樣性最高。而G3 樣品的H 值最小，為1.92；G2 樣品的H 值與G3 非常接近，為1.94。

由圖6可知，各樣品中酵母菌的豐富度S 值與H 值的變化趨勢不完全一致，而H 值高的樣品S 值也相對較高。Y10 樣品的S 值最高為34，G3的S 值最低，僅為10。樣品G2、G3、B4、B5 和X11的S 值比較接近，范圍是10～14。

圖5 不同樣品DGGE 條帶的多樣性指數(shù)分布圖Fig.5 Profiles of Shannon-Weaver index H for the samples

圖6 不同樣品的豐度指數(shù)分布圖Fig.6 Profiles of S index for the samples

3 討論

駝乳發(fā)酵過程中乳酸菌的乳酸發(fā)酵和酵母菌的酵母發(fā)酵不可或缺，乳酸菌在40 ℃左右最容易生長繁殖，而酵母菌在20～25 ℃的生長繁殖能力較強(qiáng)，因此溫度低時(shí)酵母菌的酒精發(fā)酵占優(yōu)勢。而發(fā)酵駝乳釀制過程中往往在室溫下進(jìn)行，室溫條件下酵母菌在駝乳發(fā)酵過程中占據(jù)優(yōu)勢。乳源酵母菌大多來源于原料乳，而環(huán)境、加工設(shè)備與周圍環(huán)境中存在外源微生物[28]。乳是微生物最好的營養(yǎng)源，酵母菌來源復(fù)雜，它們可能對產(chǎn)品品質(zhì)有加強(qiáng)作用，也可能對產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生不好影響，同時(shí)有一部分又可能是致病菌。因此對牧民家庭生產(chǎn)的發(fā)酵駝乳中酵母菌分離、鑒定是抑制有害酵母，保證發(fā)酵駝乳安全并有利于有益酵母開發(fā)新產(chǎn)品的有效手段。

國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵駝乳中優(yōu)勢酵母菌的報(bào)道不盡相同，劉玉華等[29]從新疆塔城和豐地區(qū)發(fā)酵駝乳中分離出東方伊薩酵母 （Issatchenkia orientails）、釀酒酵母；韓志國[30]從新疆烏魯木齊市近郊5 份發(fā)酵駝乳分離發(fā)現(xiàn)發(fā)酵畢赤酵母為主要酵母菌。Lore 等[31]分離肯尼亞傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中主要酵母菌為克魯斯假絲酵母（Candida krusei）；而倪慧娟 等[32]、Rahman 等[33]、Yam 等[34]分別從新疆伊犁、博州、巴州，新疆喀納斯地區(qū)和伊朗傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中分離出優(yōu)勢酵母菌株為馬克斯克魯維酵母和乳酸克魯維酵母。

本試驗(yàn)利用PCR-DGGE 電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)馬克斯克魯維酵母（圖2a 條帶1）和單胞釀酒酵母（圖2a 條帶2）在全部樣品（除K12）中都存在，而白地霉僅在B5 中存在。2014年，Akhmetsadykova 等[35]利用DGGE 電泳技術(shù)對哈薩克斯坦不同地區(qū)Shubat 酵母菌優(yōu)勢條帶分析，不同地區(qū)的樣品中都有單胞釀酒酵母（圖2a 條帶2），釀酒酵母（圖2a 條帶3）和馬克斯克魯維酵母（圖2a 條帶4），而布魯塞爾德克酵母（Dekkera bruxellensis）和白地霉（圖2a 條帶5）只在一些樣品中存在。由于新疆伊犁地區(qū)和哈薩克斯坦距離接近，環(huán)境氣候相似，人文文化有一定的相通性，且發(fā)酵駝乳產(chǎn)地集中在這一地區(qū)，二者結(jié)果相似，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠。

4 結(jié)論

1） 利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)篩選出35 株酵母菌，生化鑒定結(jié)合形態(tài)觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果：8 株馬克斯克魯維酵母；15 株單胞釀酒酵母；9 株林德納克勒克酵母；2 株釀酒酵母；1 株白地霉，其中單胞釀酒酵母是優(yōu)勢菌屬。

2） DGGE 圖譜中優(yōu)勢條帶測序，經(jīng)過比對知樣品中蘊(yùn)含馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母、單胞釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、發(fā)酵畢赤酵母、解脂耶氏酵母和白地霉等酵母菌。

3） 對PCR-DGGE 指紋圖譜分析可知，樣品中酵母菌相似性范圍是21.9%～73.9%，多樣性指數(shù)H 在1.92～3.41 之間，豐度S 則在10～34 之間，在40%水平上樣品基本聚為四簇。