陳百瑩 鄭 苗 鄧澤元 李紅艷

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

植物乳桿菌ZJ316 （Lactobacillus plantarum ZJ316）與人們的生活息息相關(guān)[1]，具有一定的保健功能[2]，可以平衡腸道內(nèi)菌群[3]，增強(qiáng)免疫力[4]，促進(jìn)營養(yǎng)吸收，能通過胃和腸道發(fā)揮有益作用[5-6]，已在功能性食品市場普及，受到越來越多消費(fèi)者的重視和喜愛。

在乳制品、肉類、發(fā)酵果汁和許多蔬菜發(fā)酵中，人們利用乳酸菌作為發(fā)酵劑，從而獲得許多發(fā)酵制品[7]。一般認(rèn)為，菌體密度達(dá)到108～109的菌液才適合做固體發(fā)酵劑。在發(fā)酵劑制備過程中，采用菌體高密度培養(yǎng)的方式，既可以提高菌體密度，又能降低生產(chǎn)設(shè)備成本。有必要對植物乳桿菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)[8]。高密度培養(yǎng)（High cell-density culture，HCDC）是指運(yùn)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和設(shè)備，以較低成本顯著提高菌體密度，并獲得較高的比生產(chǎn)率的方法[9]。菌體的高密度培養(yǎng)主要包括培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。熊濤等[10]采用高密度培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)植物乳桿菌，菌體濃度可達(dá)到9.3×109CFU/mL。在采用高密度培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)植物乳桿菌的過程中，為了調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，常使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方法。為使補(bǔ)加物質(zhì)能夠最大限度地促進(jìn)菌體生長或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，根據(jù)菌體生長和初始培養(yǎng)基的條件，在分批培養(yǎng)的某些階段以某種方式間歇或連續(xù)地補(bǔ)加一定物料，使菌體及其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間延長。補(bǔ)料分批培養(yǎng)（又稱流加培養(yǎng)） 應(yīng)用范圍十分廣泛[11]。

本研究對本實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏的一株植物乳桿菌ZJ316 的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)研究培養(yǎng)基初始pH 值、菌種接種量、溶氧量、培養(yǎng)溫度、分批補(bǔ)料策略和菌體收集條件對植物乳桿菌菌體密度的影響，得到植物乳桿菌ZJ316 的高密度培養(yǎng)優(yōu)化方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種 植物乳桿菌ZJ316，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖10 g，Tween-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，蒸餾水加至1 000 mL，pH 6.2 用于乳酸菌培養(yǎng)。以上試劑均購于西隴化工股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HWS-150型恒溫恒濕箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雷磁PHS-25 型數(shù)顯pH 計(jì)，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-82N 臺式恒溫振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將菌種放入裝有50 mL 液體MRS 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鮮膜密封，于30 ℃，180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)13 h。

1.2.2 種子液的制備 將活化好的菌種轉(zhuǎn)接至液體MRS 培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，待接種。

1.2.3 菌密度測定與菌落計(jì)數(shù) 將菌種活化后接種入試驗(yàn)設(shè)計(jì)的液體培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，稀釋5 倍后用紫外分光光度計(jì)測定菌液600 nm 波長處吸光值。采用菌落平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化 分別探究不同濃度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸二胺、吐溫-80、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂和硫酸錳對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響。

MRS 培養(yǎng)基中其它組分的含量保持不變，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，按照體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入于不同葡萄糖含量的各培養(yǎng)基中，于恒溫恒濕箱內(nèi)35 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h，測定菌體培養(yǎng)液的菌體密度。以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別控制其它各培養(yǎng)基組分濃度如下：蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%，0.5%，1%，1.5%，2%；牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%，0.5%，1%，1.5%，2%；酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%，0.5%，1%，1.5%，2%；檸檬酸二銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%；吐溫-80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%；磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%。0.1%，0.2%，0.3%和0.4%；乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%；硫酸鎂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.03%，0.04%，0.05%，0.06%，0.07%；硫酸錳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.005%，0.01%，0.015%，0.025%，0.035%。與確定葡萄糖最佳濃度方法相同，接種2%的植物乳桿菌ZJ316 于不同濃度各組分培養(yǎng)基中，在恒溫恒濕箱內(nèi)35 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h，測定菌體培養(yǎng)液的菌體密度。

1.2.4.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì) Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)法可以從眾多的試驗(yàn)因素中篩選出對響應(yīng)值影響最大的幾個(gè)因素，試驗(yàn)次數(shù)少，快速且有效[12]。該方法數(shù)據(jù)處理簡單，且能快速而準(zhǔn)確的達(dá)到篩選主要因素的目的，從而減少不必要的試驗(yàn)造成的時(shí)間和資源浪費(fèi)[13]。

本試驗(yàn)根據(jù)已確定的各成分最佳添加量，采用n=17 的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，考察10 個(gè)影響因素。每個(gè)因素取高和低2 個(gè)水平，低水平“-”為單因素試驗(yàn)所得的最佳添加量，高水平“+”取低水平的1.25 倍，篩選出影響植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的重要因素。

1.2.4.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù) Plackett-Burman所得結(jié)果按照顯著影響因素影響效應(yīng)的大小及其與響應(yīng)值之間的相關(guān)系數(shù)確定各影響因素的步長和變化方向，從而以最快的速度靠近最佳區(qū)域。根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果找到植物乳桿菌ZJ316 菌體密度最高的組合為下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

1.2.4.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 響應(yīng)面分析法的主要作用是研究多種因子交互作用時(shí)刻達(dá)到的最大響應(yīng)值及其所對應(yīng)的最佳組合條件[14]。本研究以Plackett-Burman 試驗(yàn)中所獲得的顯著因素為試驗(yàn)基礎(chǔ)，將最陡爬坡試驗(yàn)中所獲得的各影響因素的最佳值作為中心點(diǎn)，利用中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)出響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.2.5 植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.5.1 初始pH 的選擇 將優(yōu)化后的100 mL 植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)液加入到250 mL 錐形瓶中，利用NaOH 溶液和鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH 分別至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，接種量2%，于35 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h，測定植物乳桿菌ZJ316 菌體密度（OD600nm），確定植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)基最佳初始pH 值。

1.2.5.2 接種量的選擇 將優(yōu)化后的100 mL 植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)液加入到250 mL 錐形瓶中，分別按體積分?jǐn)?shù)1%，2%，3%，4%，5%的接種量接入菌種，于35 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h，測定菌體密度，確定其最佳接種量。

1.2.5.3 溶氧量的選擇 將優(yōu)化后的100 mL 植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)液加入到250 mL 錐形瓶中，接種量2%，在30 ℃的搖床中分別于0，40，80，120，160 r/min 條件下培養(yǎng)18 h，測定菌體密度，確定其最佳溶氧條件。

1.2.5.4 培養(yǎng)溫度的選擇 將優(yōu)化后的100 mL植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)液加入到250 mL 錐形瓶中，接種量2%，在20，25，30，35，40 ℃的條件下靜置培養(yǎng)18 h，測定菌體密度，確定其最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.6 不同補(bǔ)料培養(yǎng)方案對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響 利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，分別測定在只添加碳源和添加5∶1 的碳氮源2 種補(bǔ)料策略下的菌體密度，并與未加補(bǔ)料對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響進(jìn)行比較。

1.2.7 菌體最佳收集條件的確定 在無菌條件下，將菌液移入滅菌后的離心管中，4 ℃分別在4 000，5 000，6 000 r/min 的條件下離心10，20，30 min，棄上清液，加入等量的無菌生理鹽水，混合均勻后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

由圖1a 可知，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時(shí)，菌體密度最大。分析原因可能是高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖抑制了植物乳桿菌ZJ316 的正常生長。楊加懷[15]報(bào)道植物乳桿菌（L.plantarum）299 優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，與本研究結(jié)果相差不大。由此可得出葡萄糖最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

由圖1b 可看出，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.5%時(shí)，隨著蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加菌體密度逐漸增大，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.5%時(shí)，菌體密度無明顯變化，說明此時(shí)蛋白胨的添加量已滿足菌體的生長需要。因此可得出蛋白胨最佳添加量為0.5%。

由圖1c 可知，當(dāng)牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.5%時(shí)，隨著牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加菌體密度逐漸增大，當(dāng)牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.5%時(shí)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛肉膏限制了植物乳桿菌ZJ316 的增殖，菌體密度下降。因此選擇牛肉膏的最佳添加量為0.5%。

由圖1d 可知，酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.5%時(shí)，不能滿足植物乳桿菌ZJ316 高密度培養(yǎng)的需求；當(dāng)酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.5%時(shí)，反而抑制了植物乳桿菌ZJ316 的生長。因此選擇酵母粉的最佳添加量為0.5%。由于乳酸菌的生理結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)酶體系較為簡單，許多氨基酸不能自身合成[16]，因此為滿足乳酸菌自身生長代謝需要從外界吸收氮源。作為豐富的有機(jī)氮源，牛肉膏、蛋白胨和酵母粉的復(fù)合氮源既能滿足菌體生長的基本需要，又降低了成本。所以選用效果較好的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉作為培養(yǎng)基的復(fù)合氮源。

適量的檸檬酸二銨可以促進(jìn)乳酸菌的生長。由圖1e 可知，檸檬酸二銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%時(shí)獲得的植物乳桿菌ZJ316 菌體密度最大。蔡麗麗等[17]報(bào)道植物乳桿菌優(yōu)化的培養(yǎng)基成分中，檸檬酸氫二銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%，與本研究結(jié)果相近。

吐溫-80 既是表面活性劑，也是菌體生長有利因子。適量的吐溫對乳酸菌的增殖具有一定的促進(jìn)作用。由圖1f 可以看出，體積分?jǐn)?shù)為0.15%的吐溫-80 更適合植物乳桿菌ZJ316 生長，吐溫-80體積分?jǐn)?shù)偏高或偏低都會降低植物乳桿菌ZJ316菌體密度。張瑤等[18]報(bào)道，吐溫-80 作為顯著影響因子，其最佳體積分?jǐn)?shù)為0.16%，與本研究結(jié)果相近。

由圖1g 可知，適量的K2HPO4對植物乳桿菌ZJ316 菌體的生長是有利的，K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%時(shí)菌體密度最高，然而隨著K2HPO4濃度增加，菌體密度隨之下降。其原因可能是磷酸氫二鉀作為酸堿緩沖劑，能保持溶液pH 值相對穩(wěn)定。

乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳酸菌的增殖具有一定的影響，乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低不能滿足乳酸菌生長的需求，過高則抑制植物乳桿菌ZJ316 的增殖。由圖1h 可知，當(dāng)乙酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，植物乳桿菌ZJ316 菌體密度達(dá)到最大值。

由圖1i 可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的MgSO4·7H2O 可微弱的促進(jìn)植物乳桿菌ZJ316 生長。故可選定0.05%的MgSO4·7H2O 作為菌體生長的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

由圖1j 可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%的MnSO4·H2O 可微弱的促進(jìn)植物乳桿菌ZJ316 的生長，故0.025%的MnSO4·H2O 是菌體生長的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 培養(yǎng)基各組分濃度對乳酸菌ZJ316 菌體密度的影響Fig.1 The effects of concentrations of compositions culture medium on density of Lactobacillus plantarum ZJ316

2.2 Placket-Burman 設(shè)計(jì)篩選對乳酸菌高密度培養(yǎng)影響顯著的因素

根據(jù)Placket-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的組合如表2所示，并按表2依次進(jìn)行培養(yǎng)基的配制、接種和培養(yǎng)。以植物乳桿菌ZJ316 菌體密度OD600nm的平均值為響應(yīng)值，其分析結(jié)果如表1所示。

本試驗(yàn)選用MRS 培養(yǎng)基的10 種成分進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)后，通過Placket-Burman 設(shè)計(jì)篩選出對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度影響顯著的因素，由表1可以看出，在所有因素中，葡萄糖、牛肉膏和酵母粉的P 值均小于0.05，說明其對植物乳桿菌ZJ316 的生長影響效應(yīng)顯著。故選擇葡萄糖、牛肉膏和酵母粉這3 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡和響應(yīng)面試驗(yàn)。其它7 個(gè)因素影響不顯著，在后續(xù)試驗(yàn)中均保持原水平。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

由表1可看出，葡萄糖和牛肉膏對響應(yīng)值的相關(guān)系數(shù)為正，說明其添加量與植物乳桿菌ZJ316菌體密度呈正相關(guān)，應(yīng)適當(dāng)增大添加量。而酵母粉對響應(yīng)值的相關(guān)系數(shù)為負(fù)，說明其與植物乳桿菌菌體密度呈負(fù)相關(guān)，應(yīng)適當(dāng)減少其用量。根據(jù)上述結(jié)果，設(shè)計(jì)出最陡爬坡試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可以看出，第2 組組合所得的菌體密度最高，即葡萄糖添加量為2.7%，酵母粉添加量為0.45%，牛肉膏添加量為0.6%。因此本試驗(yàn)選擇第2 組數(shù)據(jù)為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1 Placket-Burman 設(shè)計(jì)的因素水平及數(shù)據(jù)分析Table 1 Level of the variables and the analysis for PB design

表2 Placket-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The arrangement and result of Box-Behnken design

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experiment design and results of steepest ascent

2.4 中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，選擇葡萄糖（X1）、酵母粉 （X2）、牛肉膏 （X3）3 個(gè)因素，利用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法，中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見表4和表5。通過Design-Expert 8.0.5 軟件進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值與葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、牛肉膏（X3）的關(guān)系如多元二次回歸方程所示：

OD = 0.89 + 0.011A + 0.01B + 0.004625C +0.0015AB+0.016AC-0.011BC-0.09A2-0.092B2-0.055C2。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表Table 4 Factors and levels in response surface design

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Scheme and results of response surface design

由表6可知模型P＜0.0001，表明該模型效應(yīng)極顯著，失擬項(xiàng)P=0.5688＞0.1，沒有顯著性意義，說明該模型可以很好的擬合實(shí)際情況，模型的可信度分析可見表7，模型變異較小，說明此回歸方程的擬合度良好，失擬不顯著。因此，該模型可用于植物乳桿菌ZJ316 培養(yǎng)基的優(yōu)化。

響應(yīng)曲面圖及等高線圖直觀反映各因素及其之間的交互作用，根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖及等高線圖見圖2。等高線的形狀可以表示交互作用的強(qiáng)弱。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[19]。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表Table 6 Variance analysis of the established regression equation for cell density of L.plantarum

表7 模型可信度分析Table 7 Feasibility analysis of the established regression equation for cell density of Lactobacillus plantarum

圖2 酵母粉、葡萄糖和牛肉膏對植物乳桿菌高密度培養(yǎng)交互作用的響應(yīng)曲面和等高線Fig.2 The response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast，glucose and beef on high-density culture of L.plantarum

通過對植物乳桿菌ZJ316 高密度培養(yǎng)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)可得最佳值，即葡萄糖2.71%，酵母粉0.45%，牛肉膏0.6%。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到菌體密度為0.896，與模型理論值0.891 接近。驗(yàn)證了基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化培養(yǎng)基條件參數(shù)的可靠性，具有實(shí)用價(jià)值。

2.5 植物乳桿菌ZJ316 高密度培養(yǎng)條件的研究

2.5.1 培養(yǎng)基初始pH 由圖3可知，在pH 5.0～6.0 之間，菌體密度隨著pH 值升高而增大，超過pH 6.0 菌體密度隨著pH 值升高而降低。潛在的原因是在植物乳桿菌ZJ316 增殖過程中，菌體糖代謝產(chǎn)乳酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH 值過低，氨離子濃度超過其適應(yīng)范圍的最大限度，從而抑制菌體的生長繁殖。隨著時(shí)間的推移，乳酸含量累積增加，抑制效果會更加顯著。因此培養(yǎng)基初始pH 值對植物乳桿菌ZJ316 的生長十分關(guān)鍵，過高或過低都會抑制菌體生長。由此可以確定培養(yǎng)基初始pH值應(yīng)該控制在6.0 左右。

2.5.2 接種量 由圖4可知，接種量較低，菌體生長繁殖空間相對較大，菌體密度較低。接種量過大，菌體在前期大量生長，產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)生乳酸，使pH 迅速下降，從而抑制了菌體的生長繁殖。此外，菌體前期密度過高，過快的生長速率使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，菌種容易衰老，導(dǎo)致生長速率下降，因此，接種量4%是最合適的菌種添加量。

2.5.3 溶氧量 由圖5可見，轉(zhuǎn)速在80 r/min 時(shí)，菌體密度最高。轉(zhuǎn)速大于120 r/min，菌體密度下降，可能是由于高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的機(jī)械損傷，致使菌體受到傷害，降低菌種存活率[20]。

2.5.4 溫度 由圖6可見，溫度對植物乳桿菌ZJ316 的菌體密度影響比較明顯，在35 ℃時(shí)，菌體密度OD/600 nm 達(dá)到0.997。植物乳桿菌ZJ316 細(xì)胞內(nèi)酶對溫度十分敏感，溫度過低，酶的活力降低，植物乳桿菌ZJ316 的生長能力和繁殖能力下降；酶在高溫條件下變性失活，菌體的生長受到抑制。因此，35 ℃是植物乳桿菌ZJ316 菌體生長的最佳溫度。

2.6 添加不同補(bǔ)料對植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響

圖3 培養(yǎng)基初始pH 對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響Fig.3 The effects of pH on the cell density of L.plantarum ZJ316

圖4 接種量對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響Fig.4 The effects of inoculation amount on the cell density of L.plantarum ZJ316

圖5 溶氧量對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響Fig.5 The effects of dissolving oxygen amount on the cell density of L.plantarum ZJ316

圖6 溫度對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響Fig.6 The effects of culture temperature on the cell density of L.plantarum ZJ316

2.6.1 植物乳桿菌ZJ316 生長曲線與殘?zhí)橇筷P(guān)系圖 如圖7所示，植物乳桿菌ZJ316 在培養(yǎng)3 h 后進(jìn)入對數(shù)期，此時(shí)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度急劇下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體生長繁殖加快，培養(yǎng)18 h 時(shí)菌體達(dá)到生長旺盛期，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降至極低水平，而此時(shí)菌體對碳源的需求量極大，培養(yǎng)基中的碳源明顯不能滿足植物乳桿菌ZJ316 的生長需要。因此，為維持植物乳桿菌細(xì)胞的生長繁殖，在培養(yǎng)18 h 后開始補(bǔ)充碳源，具有重要意義。

2.6.2 補(bǔ)加不同補(bǔ)料對植物乳桿菌菌體密度的影響 在培養(yǎng)18 h 后開始分批補(bǔ)料，為確定最佳補(bǔ)料方法，分別在培養(yǎng)18，22，26，30，34，38 h 和42 h 補(bǔ)料，每次補(bǔ)料15 g/L，培養(yǎng)48 h 后收獲菌體，觀察補(bǔ)料后菌體生長狀況，比較不同補(bǔ)料方案對菌體密度的影響。由圖8可知，補(bǔ)料對菌體的生長繁殖有明顯的促進(jìn)作用。在添加碳氮比為5∶1 的補(bǔ)料時(shí)，獲得的植物乳桿菌ZJ316 菌體密度更高。此時(shí)菌落總數(shù)可達(dá)9.28×109CFU/mL，比未加補(bǔ)料組提高了70.23%，充分證明了分批補(bǔ)料對提高菌體的活菌數(shù)有顯著效果。

2.7 菌體收集條件

菌體收集條件直接影響凍干前菌液的活菌數(shù)。離心速度太慢或時(shí)間太短，菌體和培養(yǎng)液難以分開，部分菌體留在上清液中，降低了菌泥中的活菌數(shù)。離心速度太快或時(shí)間過長，菌體遭受的機(jī)械損傷過大，菌體死亡率升高，菌泥中的活菌數(shù)降低。因此，選取適宜的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間對于收集菌體的成活率十分重要。同時(shí)，菌體的收集也要考慮經(jīng)濟(jì)成本，盡量用較少的時(shí)間和較低的轉(zhuǎn)速獲得較高的菌體存活率，減少轉(zhuǎn)速過大和時(shí)間過長對離心機(jī)造成的損傷。由圖9可知，植物乳桿菌ZJ316 在4 000 r/min，20 min 的條件下收集的菌體成活率最高，達(dá)到81.09%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，將植物乳桿菌ZJ316 高密度培養(yǎng)，從而得到植物乳桿菌ZJ316 的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.71%，酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.45%，牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%。

此外，本試驗(yàn)考察了不同培養(yǎng)條件對植物乳桿菌ZJ316 高密度培養(yǎng)的影響，確定了最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH 6，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速80 r/min，培養(yǎng)溫度35 ℃。在此優(yōu)化條件下采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，添加碳氮比為5∶1 的補(bǔ)料時(shí)，菌體密度可達(dá)9.28×109CFU/mL，比未加補(bǔ)料提高了70.23%。植物乳桿菌在4 000 r/min，20 min 的條件下收集的菌體成活率最高，達(dá)到81.09%。

圖7 植物乳桿菌ZJ316 生長曲線Fig.7 The course of L.plantarum ZJ316 cell growth

圖8 不同補(bǔ)料方案對植物乳桿菌ZJ316 菌體密度的影響Fig.8 Effects of different feeding batch over cell density of L.plantarum ZJ316

圖9 不同轉(zhuǎn)速和時(shí)間對植物乳桿菌ZJ316 菌體成活率的影響Fig.9 The influence of different rotational speed and time on the survival rate of L.plantarum ZJ316