王 丹，趙亞光，張鳳華

(石河子大學(xué)/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

土壤鹽漬化是世界性問(wèn)題，全球鹽漬化土壤面積約為1×109hm2，而我國(guó)是世界鹽堿地大國(guó)之一，鹽漬化土壤總面積約為0.99×108hm2[1]。鹽堿地由于含有大量硫酸鹽、氯化物及重碳酸鹽成分，導(dǎo)致土壤板結(jié)硬化、透水性差、肥力下降等而使農(nóng)作物減產(chǎn)[2]，已嚴(yán)重制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。極端高鹽、高堿環(huán)境導(dǎo)致動(dòng)、植物難以生存，但卻蘊(yùn)藏著大量的耐鹽堿、甚至嗜鹽堿的微生物類(lèi)群[3-5]。這些微生物的生命活動(dòng)在改變鹽堿地土壤理化性質(zhì)的同時(shí)，也受土壤極端理化性質(zhì)的影響，從而形成適應(yīng)高鹽堿環(huán)境的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、遺傳特性和生理功能[6]。有些菌株除了具有耐鹽堿能力之外并具有固氮、溶磷(無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷)、分泌植物激素的能力。例如丁琳琳等[7]從鹽堿土中分離得到12株耐鹽堿菌，發(fā)現(xiàn)這12株耐鹽菌都具有產(chǎn)ACC脫氨酶、鐵載體及溶磷能力，產(chǎn)IAA。許芳芳等[8]和Dai等[9]分別對(duì)內(nèi)蒙古荒漠植物根際土壤和寧夏荒漠草原土壤進(jìn)行耐鹽堿細(xì)菌分離，發(fā)現(xiàn)所得耐鹽堿細(xì)菌兼具固氮、解無(wú)機(jī)磷、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC脫氨酶的功能特性。Komal等[10]從印度戈?duì)柟紶桘}漬化土壤中分離篩選出一株陰溝腸桿菌，該菌株在鹽脅迫下可維持ACC脫氨酶活性，增溶磷酸鹽，產(chǎn)吲哚乙酸、鐵載體、氰化氫和胞外多糖。

小麥?zhǔn)侨蛑饕Z食作物之一，鹽脅迫可直接導(dǎo)致小麥品質(zhì)和產(chǎn)量下降[11]，Upadhyay等[12]和Pourbabaei等[13]研究表明，耐鹽芽孢桿菌能提高鹽脅迫小麥莖部及根系生物量。許芳芳等[8]將分離自荒漠地區(qū)的促生菌接種于鹽脅迫處理小麥，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小麥莖鮮重和干重有顯著促進(jìn)作用。李鳳霞等[14]將耐鹽促生菌株接種于小麥和燕麥種子，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小麥、燕麥的根部具有明顯促生長(zhǎng)作用。馬驄毓等[15]將從西藏阿里地區(qū)的披堿草根系及根際土分離篩選出的促生菌接種于披堿草，發(fā)現(xiàn)這些促生菌均在不同程度上增加了披堿草株高、根長(zhǎng)及干重。趙龍飛等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在250 mmol·L-1鹽脅迫下，接種內(nèi)生菌的小麥幼苗POD和CAT活性較對(duì)照均顯著增加。以上研究表明，耐鹽促生菌可以緩解作物鹽毒害，對(duì)促進(jìn)作物生產(chǎn)有著重要作用。因此，本研究擬從新疆瑪納斯河流域鹽堿土壤中分離耐鹽菌并將其接種于小麥，測(cè)定其在鹽脅迫下對(duì)小麥生長(zhǎng)及生理特性的影響，以期為耐鹽促生菌的開(kāi)發(fā)和小麥耐鹽脅迫栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

土壤樣品采集地點(diǎn)位于新疆瑪納斯河流域沖積扇緣地帶十戶灘鎮(zhèn)(44°37′N(xiāo)，86°10′E)，地處準(zhǔn)噶爾盆地南緣，常年干旱少雨，蒸發(fā)強(qiáng)烈，年降水量約為110～200 mm，年蒸發(fā)量達(dá)1 500～2 000 mm，年平均氣溫6.6 ℃，≥ 10 ℃積溫為 3 490 ℃，無(wú)霜期為148～187 d，屬于典型的大陸性氣候。于2018年4月以“五點(diǎn)法”進(jìn)行取樣，取樣土層為0～20 cm，將采集土壤裝入無(wú)菌自封袋中，低溫保存迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。土壤類(lèi)型為灰漠土，土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分狀況見(jiàn)表1。

表1 供試土壤樣品基礎(chǔ)養(yǎng)分Table 1 Basic nutrient of soil samples tested

1.2 耐鹽菌的分離與篩選

稱取土樣10 g放入含有玻璃珠的無(wú)菌水中，充分振蕩使土顆粒分散，靜置片刻。取上清用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋(1∶100；1∶1 000； 1∶10 000)后，吸取稀釋液100 μL于含120 g·L-1NaCl的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻于 30 ℃培養(yǎng)一周后，將形態(tài)不同的菌落在新鮮LB固體培養(yǎng)基平板上純化，直至獲得細(xì)菌純培養(yǎng)物，并給菌株編碼。

1.3 菌株促生性能測(cè)定及篩選

菌株分泌IAA能力測(cè)定采用Salkowski比色液法[17]；溶磷能力采用鉬銻抗比色法培養(yǎng)2 d后測(cè)定[18]；鐵載體能力測(cè)定采用CAS檢測(cè)液法[19]；固氮能力測(cè)定采用點(diǎn)接阿須貝培養(yǎng)基法[20]。 根據(jù)被測(cè)指標(biāo)篩選目標(biāo)菌。

1.4 菌株最佳培養(yǎng)條件的確定

將所篩選目標(biāo)菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h(30 ℃，180 r·min-1)，作為種液。

1.4.1 最佳溫度的確定

將種液按1%接種量接種于pH為7.0的LB液體培養(yǎng)基中，分別于24、27、30、33、36、39 ℃條件下，180 r·min-1培養(yǎng)24 h，以不接菌為對(duì)照，測(cè)定菌懸液在600 nm處OD值，3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 最佳 pH的確定

將種液按1%接種量分別接種于pH值為6、7、8、9、10、11的LB液體培養(yǎng)基中，在最適溫度條件下，180 r·min-1培養(yǎng)24 h，以不接菌為對(duì)照，測(cè)定菌懸液在600 nm處OD值，3個(gè)重復(fù)。

1.4.3 最佳 NaCl濃度的確定

將種液按1%接種量分別接種于NaCl濃度為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%的LB液體培養(yǎng)基中，在最適溫度、pH 條件下，180 r·min-1培養(yǎng)24 h，以不接菌為對(duì)照，測(cè)定菌懸液在600 nm處OD值，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 菌株形態(tài)、生理生化鑒定及菌株16S rDNA 序列分析

菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定參考東秀珠[21]方法；菌株16S rDNA 序列分析參考馬驄毓[18]方法。

1.6 小麥鹽脅迫濃度的確定

小麥品種為新春5號(hào)，由石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將清洗過(guò)的種子用0.1%的汞消毒5 min，并用無(wú)菌水沖洗5遍，用 5種不同濃度NaCl溶液(0、50、100、150、200 mmol·L-1)浸種8 h后，挑取大小均一的飽滿種子排列在鋪有濾紙的發(fā)芽盒(直徑12 cm)，3個(gè)重復(fù)，將其置于室溫黑暗條件下萌發(fā)24 h，然后于14 h/10 h的光/暗條件下培養(yǎng)，7 d后測(cè)定幼苗地上及地下部分鮮重，以確定盆栽鹽脅迫濃度。

1.7 菌株對(duì)鹽脅迫下小麥生長(zhǎng)的效應(yīng)

將清洗過(guò)的種子用0.1%汞消毒5 min，并用無(wú)菌水沖洗5遍，挑取大小均一的飽滿種子排列在鋪有濾紙的發(fā)芽盒(直徑12 cm)，待露白后，將3粒種子播種于300 g無(wú)菌土(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為 3∶1)的花盆(上直徑15 cm，下直徑10 cm，高13 cm)；向幼苗根部土壤中加入200 mL用1.6中確定的鹽濃度稀釋的菌懸液(108CFU·mL-1)，每隔5 d加菌懸液一次，以不接菌的同樣濃度鹽處理為對(duì)照，5個(gè)重復(fù)，于25±2 ℃的人工氣候室以14 h/10 h的光/暗條件培養(yǎng)，50 d后測(cè)植株株高、根長(zhǎng)、株鮮重及根鮮重，并采用硫代巴比妥酸法測(cè)葉片脯氨酸(Pro)和根部丙二醛(MDA)含量[22]，用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定根系的超氧化物歧化酶(SOD)活性，用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定根系的過(guò)氧化物酶(POD)活性[23]，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定根系的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性[24]。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖表，采用 SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽菌的分離篩選及其促生特性

利用含120 g·L-1NaCl的LB固體培養(yǎng)基，從所采集的鹽堿土壤樣品中初步分離出12株耐鹽菌，依次命名為wp-1、wp-2、…、wp-12。測(cè)定其生長(zhǎng)特性及產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)、鐵載體、溶磷、固氮能力后發(fā)現(xiàn)，wp-8在含L-色氨酸的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h后，其 IAA分泌量為15.90 mg·L-1；無(wú)機(jī)溶磷量和有機(jī)磷溶量分別為1.10 mg·L-1和0.34 mg·L-1；鐵載體相對(duì)含量為0.68，接近0.5，說(shuō)明其具有產(chǎn)鐵載體能力；不具有固氮能力。確定 wp-8為耐鹽高效促生菌。

2.2 菌株最佳培養(yǎng)條件的確定

2.2.1 最佳溫度的確定

由圖1可知，菌株wp-8在溫度為24～39 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌液OD600值呈先升后降趨勢(shì)，以30 ℃時(shí)最大，且顯著高于其他處理，確定其為最適生長(zhǎng)溫度。

圖柱上不同小寫(xiě)字母表示顯著差異(P<0.05)。下同。

2.2.2 最佳 pH的確定

由圖2可知，不同pH條件下，菌株wp-8菌液OD600值差異較大。當(dāng)pH為6～11時(shí)，菌液OD600值隨 pH升高先增后減，pH為9時(shí)最大，pH為10與pH為9時(shí)的差異不顯著，確定最適生長(zhǎng)pH為9～10。由此可知，wp-8在堿性環(huán)境下生長(zhǎng)狀況較佳。

圖2 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響

2.2.3 最佳 NaCl濃度的確定

由圖3可以看出，不同濃度NaCl對(duì)菌株wp-8生長(zhǎng)影響較明顯。當(dāng)NaCl濃度為4%～7%時(shí)，菌液OD600值均大于1.8，以在5%和6% 的值較大，二者差異不顯著；當(dāng)NaCl濃度為7%～16%時(shí)，菌液OD600值下降趨勢(shì)明顯，當(dāng)NaCl濃度為16%時(shí)，wp-8生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制或停止生長(zhǎng)。說(shuō)明菌株wp-8耐鹽范圍為4%～15%。

圖3 NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響

2.3 菌株wp-8形態(tài)、生理生化鑒定及菌株16S rDNA 序列分析

菌株wp-8菌體形態(tài)為球狀，菌落直徑約為1.0～1.2 mm，呈淺黃色，邊緣整齊光滑，經(jīng)革蘭氏染色確定該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌?；?6S rDNA 基因序列片段比對(duì)(圖4)，菌株wp-8 與NesterenkoniarhizosphaeraeEGI 80099相似性達(dá)99%，表明其具有較高同源性，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果(表2)初步確定菌株wp-8為Nesterenkoniarhizosphaerae。

表2 菌株wp-8主要生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of wp-8

圖4 菌株wp-8 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 最低鹽脅迫濃度的確定

不同鹽濃度處理小麥種子8 d后，幼苗鮮重結(jié)果如表3，在0～200 mmol·L-1鹽濃度脅迫下，隨著鹽濃度的增加，小麥幼苗植株鮮重和根鮮重呈下降趨勢(shì)。100 mmol·L-1與0 mmol·L-1處理間植株鮮重有顯著差異，但根鮮重?zé)o顯著差異，與50 mmol·L-1處理植株鮮重、根鮮重均無(wú)顯著差異。150 mmol·L-1、200 mmol·L-1處理較50、100 mmol·L-1處理植株鮮重和根鮮重顯著下降(P<0.05)，而150 mmol·L-1、200 mmol·L-1處理間無(wú)顯著差異。確定150 mmol·L-1NaCl為最低鹽脅迫濃度。

表3 不同鹽濃度處理對(duì)小麥幼苗株鮮重及根鮮重的影響Table 3 Effects of different salt concentrations on fresh weight of wheat seedlings g·plant-1

2.5 鹽脅迫下菌株wp-8對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)特性的影響

由表4可知，150 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，wp-8菌懸液處理的小麥幼苗在生長(zhǎng)至50 d時(shí)，其株高、根長(zhǎng)、根重均顯著高于對(duì)照(P< 0.05)，株高增加2.83 cm，提高9.35%；根長(zhǎng)增加6.00 cm，提高27.15%；根鮮重增加0.06 g，提高150.00%。株鮮重有所提高，但差異不顯著。說(shuō)明菌株wp-8對(duì)小麥幼苗鹽脅迫具有良好的緩解效應(yīng)，尤其對(duì)根系的發(fā)育。

表4 菌株wp-8對(duì)150 mmol·L-1鹽脅迫下小麥生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of wp-8 strain on growth of wheat under 150 mmol·L-1salt stress

2.6 鹽脅迫下菌株wp-8對(duì)小麥幼苗生理特性的影響

由表5可知，鹽脅迫下接種菌株wp-8可顯著降低小麥幼苗根部MDA含量，較對(duì)照下降 29.55%，說(shuō)明接種菌株wp-8可以明顯減緩鹽脅迫對(duì)小麥幼苗膜系統(tǒng)的傷害程度；Pro含量較對(duì)照顯著增加(P<0.05)，提高了10.03%，表明菌株wp-8能夠提高鹽脅迫小麥幼苗的脯氨酸含量。菌株wp-8處理小麥幼苗根部的SOD、POD、CAT活性均顯著高于對(duì)照(P< 0.05)，分別較對(duì)照提高160.63%、30.41%、44.93%，其中SOD活性增加程度最大。說(shuō)明菌株wp-8能夠有效調(diào)節(jié)在一定的鹽脅迫條件下小麥幼苗的保護(hù)酶系統(tǒng)，推測(cè)可緩解小麥幼苗受傷害程度。

表5 菌株wp-8對(duì)150 mmol·L-1鹽脅迫下小麥生理特性的影響Table 5 Effects of wp-8 strain on physiological characteristics of wheat under 150 mmol·L-1salt stress

3 討 論

鹽脅迫是鹽堿地抑制植物生長(zhǎng)、降低農(nóng)作物產(chǎn)量的最常見(jiàn)非生物脅迫。從鹽堿地挖掘耐鹽促生菌種資源，利用其改良鹽堿土壤、促進(jìn)植物生長(zhǎng)是解決鹽堿地問(wèn)題的有效途徑之一。大量研究表明，來(lái)源于鹽堿地的土壤微生物可以通過(guò)自身代謝產(chǎn)生植物激素，且具溶磷、固氮等促生特性[10, 25-26]。本研究從新疆鹽堿土壤中篩選出耐鹽度高達(dá)15%的菌株wp-8，該菌株具有部分促生特性，其吲哚乙酸分泌量為15.90 mg·L-1，鐵載體相對(duì)含量為0.68，溶有機(jī)磷及無(wú)機(jī)磷量分別為0.34 mg·L-1和1.10 mg·L-1，鑒定該菌為Nesterenkoniarhizosphaerae。

促生菌(PGPR)在鹽脅迫下通過(guò)誘導(dǎo)植物建立耐受機(jī)制，提高植物抗鹽性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)IAA的假單胞菌接種于鹽脅迫下苗木種子后，芽長(zhǎng)較對(duì)照增加52%，根長(zhǎng)增加40%[27]。另外，IAA可以通過(guò)誘導(dǎo) ACC 脫氨酶的活性，降低乙烯濃度，促進(jìn)植物快速生長(zhǎng)。將耐鹽陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)接種于油菜，發(fā)現(xiàn)油菜體內(nèi) IAA量增加而乙烯量減少[28]。部分PGPR自身含有ACC 脫氨酶，可分解乙烯合成前體ACC，使植物抵抗鹽損傷。將具耐鹽性的阿氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)接種于小麥，發(fā)現(xiàn)對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[29]。PGPR還可間接分泌鐵載體減緩植物在鹽逆境中毒害作用，同樣其溶磷性能也是促進(jìn)作物生長(zhǎng)重要因素之一，通過(guò)溶解土壤中難溶性磷，提高植物對(duì)磷的吸收。將溶磷量達(dá)424.85 g·mL-1促生菌RW8接種白三葉種子，可顯著增加白三葉幼苗鮮重和干重[30]。將具溶磷和產(chǎn)鐵載體能力的PGPR接種于檸條種子，發(fā)現(xiàn)能顯著促進(jìn)檸條幼苗生長(zhǎng)，尤其促進(jìn)地下部的生長(zhǎng)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種促生菌wp-8可顯著提高小麥幼苗株高、根長(zhǎng)、根重(P<0.05)。小麥幼苗地下部分(根長(zhǎng)和根鮮重)的增長(zhǎng)率均高于地上部分，這與Glick[32]研究結(jié)果一致，可能因?yàn)橹参锔渴窃谀婢持兄苯痈惺苄盘?hào)的部位，菌株wp-8通過(guò)分泌植物激素IAA促進(jìn)小麥根系延伸，使根系吸收更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)地上部分生長(zhǎng)[33]。推測(cè)小麥抗鹽性提高是菌株分泌生長(zhǎng)素和溶磷能力的共同作用，但其促生作用是否與ACC 脫氨酶活性有關(guān)還有待研究。

鹽脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧、營(yíng)養(yǎng)平衡遭到破壞、胞內(nèi)紊亂、細(xì)胞膜破裂等導(dǎo)致植物體內(nèi)一些酶功能喪失，表現(xiàn)出植物生長(zhǎng)緩慢、代謝受阻，嚴(yán)重時(shí)可造成葉片萎蔫甚至死亡[34]。研究表明，鹽脅迫下促生菌(PGPR)通過(guò)分泌滲透保護(hù)物質(zhì)提高植物抗鹽性，脯氨酸含量變化最大，它可通過(guò)增加胞內(nèi)溶質(zhì)濃度、調(diào)節(jié)滲透平衡減緩鹽對(duì)植物的毒害，并自身啟動(dòng)酶促系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)以清除過(guò)多活性氧來(lái)抵御外界環(huán)境，有效改善鹽脅迫下植物生長(zhǎng)及生理代謝過(guò)程[35-37]。本研究中，菌株wp-8接種于鹽脅迫小麥后，小麥幼苗MDA含量顯著降低，脯氨酸含量及SOD、POD、CAT活性顯著提高，該結(jié)果與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的接種促生菌可提高作物抗鹽性、促進(jìn)作物生長(zhǎng)的結(jié)果一致[38-40]。但本研究?jī)H說(shuō)明在150 mmol·L-1NaCl濃度脅迫下接種wp-8可緩解小麥?zhǔn)苎趸該p傷，在更高濃度鹽脅迫下菌株wp-8是否發(fā)揮其保護(hù)功能有待進(jìn)一步研究。