陳 芳，李 欣，喬麟軼，李 銳，郭慧娟，常利芳，張樹偉，閻曉濤，暢志堅,3，張曉軍,3，李東方

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室,山西太原 030031； 3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,山西太原 030031； 4.新疆生產(chǎn)建設兵團第六師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆五家渠 831300)

由活體營養(yǎng)型真菌Blumeriagraminisf. sp.tritici(Bgt)引起的白粉病是小麥的一種主要病害，可嚴重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。培育并種植適應當?shù)氐目共⌒←溒贩N是控制該病害最為有效、經(jīng)濟并對環(huán)境安全的措施[2]。然而，小麥白粉菌生理小種多，毒性基因變異快，多數(shù)推廣的抗病品種廣泛種植3～5年后便開始喪失抗性[3-4]。因此，亟需持續(xù)挖掘和定位新的抗白粉病基因，開發(fā)與其緊密連鎖的分子標記，通過分子標記輔助選擇，加速小麥抗病育種進程。

分子標記輔助選擇是利用分子標記與目標性狀基因緊密連鎖或共分離的特點，通過檢測分子標記的基因型來跟蹤目標基因的存在，不受環(huán)境影響，可快速、準確地對目標基因進行選擇[5-6]。目前，借助分子標記輔助選擇已將多個白粉病抗性基因轉(zhuǎn)育到生產(chǎn)品種中。Xu等[7]通過與Pm2b緊密連鎖的標記Xbwm20、Xbwm21、Xbwm25和Xcfd81構建了含Pm2b基因的以推廣品種石麥15、石新828和科農(nóng)199為遺傳背景的近等基因系；劉金元等[8]借助與Pm2及Pm4a緊密連鎖的標記對小麥品種或品系進行輔助選擇，成功獲得了含有3個白粉病抗性基因組合“Pm2+Pm4a”、“Pm2+Pm21”和“Pm4a+Pm21”的優(yōu)異小麥品種揚麥158；桑大軍等[9]通過回交育種與分子標記相結(jié)合將抗白粉病基因Pm13、Pm21、Pm30和Pm33導入小麥品種鄭麥9023中，獲得了抗白粉病的鄭麥9023近等基因系，并通過雜交育種與分子標記技術相結(jié)合，育成了含白粉病抗性基因的新品種鄭麥835、鄭麥863和鄭麥883。

白粉病抗病性鑒定通常采用人工接種法進行，但其發(fā)病情況易受環(huán)境等因素影響，嚴重降低了選擇效率。育種過程中通過分子標記能高效地對該目標性狀進行選擇，而分子標記輔助選擇的關鍵是有穩(wěn)定可靠的分子標記。目前雖已開發(fā)出大量與白粉病抗性相關的分子標記，但這些標記多被應用于抗病基因的定位或克隆中，它們在不同遺傳背景下的有效性有待進一步驗證。目前，分子標記的有效性評價越來越受到育種家的關注。張維軍等[10]利用5個小麥穗發(fā)芽功能性KASP標記對185份寧夏小麥種質(zhì)資源進行穗發(fā)芽抗性篩選，發(fā)現(xiàn)標記Phs646和Phs666是穗發(fā)芽抗性鑒定的有效標記，而標記Vp1B1-83只能作為參考標記；胡洋山等[11]通過小麥分蘗成穗數(shù)基因相關分子標記與單位面積最大分蘗數(shù)和單位面積穗數(shù)的相關性研究，篩選到2個實用性的分子標記。但是關于白粉病抗性基因相關分子標記有效性評價方面的報道較少。本課題前期通過臺長29/CH1357的F2群體在小偃麥衍生品系CH1357中定位到一個顯性抗白粉病基因PmCH1357，其連鎖標記為Xgwm190-22.2-Xbwm9-1.5-Xbwm8-11.3-PmCH1357-2.0-Xcfd81-0.8-Xbwm20-0.3-Xbwm21-0.7-Xbwm25-1.7-Xmp510。鑒于此，本研究利用前期定位的8個相關分子標記對以感白粉病品種晉麥66和抗白粉病品系CH1357構建的341個F2:3家系進行PCR檢測，驗證并評估這8個相關分子標記在該群體中的有效性及實用性，以期為小麥抗病育種的分子標記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與白粉病菌株

白粉病苗期抗病性鑒定材料包括抗病親本CH1357(中8701//冀麥26/小偃7430)、感病品種晉麥66(原名太原610，由土耳其材料62166為母本，太原251為父本雜交選育而成)[12]及由二者構建的341個F2:3家系。

苗期白粉病抗性鑒定所用菌株E09由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所周益林研究員惠贈，本課題組通過活體幼苗保存。該菌株是在中國中部和北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一個廣譜型白粉菌株，對Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm5e、Pm12、Pm16、Pm21和Pm30等抗白粉病基因表現(xiàn)為無毒，而對Pm1、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm5a、Pm17和Pm19等抗白粉病基因表現(xiàn)為有毒[13]。

1.2 苗期白粉病抗性鑒定

在山西省農(nóng)業(yè)科學院人工培養(yǎng)氣候室中對供試材料進行苗期白粉病抗性鑒定。用75%的無水乙醇對每個株系的種子浸泡消毒后種植于72穴的育苗盤，每穴5粒種子，每個育苗盤種植8穴對照品種臺長29作為誘發(fā)穴，以確保病害的充分發(fā)生。人工氣候室條件為光照強度125 μmol·m-2·s-1，光周期12 h，溫度16～22 ℃(光照時22 ℃，無光照時16 ℃)，濕度70%左右。種植大約10 d后，用預先繁殖的新鮮白粉菌人工掃抹幼苗，每株系處理10株苗，重復鑒定3次。接菌大約10 d后，待感病對照晉麥66充分發(fā)病后，用 0～4級分級標準[14]逐一調(diào)查每個株系的反應類型。其中0級為免疫型，0；級為近免疫型，1級為高抗型，2級為中抗型，3級為中感型，4級為高 感型。

1.3 抗白粉病基因標記

試驗選用本課題組前期在(臺長29/CH1357)F2群體中定位的8個與白粉病抗性基因PmCH1357相關的分子標記，驗證并評價其在不同遺傳背景中的有效性，引物信息詳見表1。

表1 8對與抗白粉病基因 PmCH1357連鎖的標記及引物序列Table 1 Eight markers linked to the powdery mildew resistance gene PmCH1357 and primers applied in this study

1.4 基因組DNA提取及PCR擴增

在三葉期剪取親本及341個F2:3家系植株的幼嫩葉片，液氮冷凍研磨后，用CTAB法[18]提取基因組DNA，用NANODROP 2000分光光度計測定DNA濃度和純度后，進行PCR擴增。PCR擴增體系為10 μL，含1.0 μL DNA模板(50 ng·μL-1)、1.0 μL 10×buffer(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol·L-1KCl，1.5 mmol·L-1MgCl2)，0.25 μL dNTP (0.2 mmol·L-1)、0.4 μL引物(10 μmol·L-1)、0.2 μL Taq酶和7.15 μL ddH2O。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55～62 ℃(依引物退火溫度而定)復性45 s，72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr與Bis質(zhì)量比為29∶1)電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，硝酸銀染后，甲醛溶液中顯色照相并統(tǒng)計標記基因型帶型。

2 結(jié)果與分析

2.1 8對抗白粉病基因(PmCH1357)相關標記的基因型檢測結(jié)果

利用(臺長29/CH1357)群體中定位的抗白粉病基因PmCH1357的8對相關標記對晉麥66/CH1357的341個F2:3單株進行基因型檢測，結(jié)果(表2)表明，8對相關標記中只有標記Xmp510為顯性標記，不能區(qū)分純合抗病基因型和雜合抗病基因型，其余7對標記均為共顯性標記，能清晰地區(qū)分純合抗病基因型和雜合抗病基因型。部分標記PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果見圖1。

表2 8對抗白粉病基因( PmCH1357)連鎖標記在(晉麥66/CH1357)F2:3家系中的擴增帶型分布Table 2 PCR amplification patterns of the eight markers associated with powdery mildew resistance gene PmCH1357 in the population of(Jinmai 66/CH1357) F2:3 lines

2.2 單個連鎖標記選擇的有效性

利用白粉病菌株E09對上述標記檢測為純合抗病基因型的單株進行苗期白粉病抗性鑒定。結(jié)果表明(表3)，標記Xcfd81檢測的63個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為62個，基因型與表型符合率為98.4%；標記Xbwm21檢測的66個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為63個，基因型與表型符合率為95.5%；標記Xbwm20檢測的65個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為62個，基因型與表型符合率為95.4%；標記Xbwm25檢測的65個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為61個，基因型與表型符合率為 93.8%；標記Xbwm8檢測的63個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為54個，基因型與表型符合率為85.7%；標記Xbwm9檢測的63個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為54個，基因型與表型符合率為85.7%；標記Xgwm190檢測的77個純合抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為41個，基因型與表型符合率為53.2%；標記Xmp510檢測的267個抗病基因型株系中，表現(xiàn)為純合抗病的株系為69個，基因型與麥型符合率為25.8%。

2.3 標記組合在分子標記輔助選擇中的有效性

將不同標記兩兩組合，進一步分析其在分子標記輔助選擇中的有效性，結(jié)果見表3。從基因型與表型符合率來看，單獨用Xcfd81對PmCH1357進行選擇時，基因型與表型符合率為98.4%；用標記組合Xcfd81+Xbwm8、Xcfd81+Xbwm9或Xcfd81+Xgwm190進行選擇時，基因型與表型符合率均可達到100%；但用標記組合Xcfd81+Xbwm21、Xcfd81+Xbwm20和Xcfd81+Xbwm25進行選擇時，基因型與表型的符合率為98.4%，與單獨使用Xcfd81的結(jié)果相同。單獨使用Xbwm21、Xbwm20或Xbwm25對PmCH1357進行選擇時，基因型與表型的符合率分別為95.5%、95.4%和93.8%；當它們分別與Xbwm8、Xbwm9或Xgwm190組合使用時，基因型與表型的符合率均達到97%以上，甚至100%；但Xcfd81、Xbwm21、Xbwm20和Xbwm25兩兩組合使用時，基因型與表型的符合率與該2個標記中遺傳距離較近的標記相比無明顯差異。Xgwm190、Xbwm9和Xbwm8兩兩組合使用時，基因型與表型的符合率與該2個標記中遺傳距離較近的標記相比無明顯差異。表明使用基因兩側(cè)的標記進行篩選可獲得更高的選擇準確率。

Pr：抗病親本CH1357；Ps：感病親本晉麥66；1～22：F2:3群體株系編號。

從獲得的純合抗病表型株系數(shù)量來看，單獨使用1個標記進行選擇時，除Xmp510為顯性標記，無法準確區(qū)分純合抗病與雜合抗病基因型外，遺傳距離較近的標記可以獲得較多的抗病株系，而遺傳距離較遠的標記獲得的抗病株系則較少，表明連鎖標記與抗病基因的遺傳距離是影響選擇效率的一個重要因素。從表3可以看出，當使用2個標記組合進行選擇時，篩選出的純合抗病株系數(shù)量與遺傳距離較遠的標記篩選的株系數(shù)量相比沒有明顯差異，甚至有所減少。如在PmCH1357的下游，Xbwm25的遺傳距離較遠，單獨使用Xbwm25篩選獲得的純合抗病株系數(shù)量為61個，而使用Xcfd81+Xbwm25、Xbwm21+Xbwm25和Xbwm20+Xbwm25標記組合篩選獲得的純合抗病株系數(shù)量則分別是60、61和61個，與單獨使用Xbwm25篩選結(jié)果無明顯差異。Xbwm8、Xbwm9或Xgwm190都位于PmCH1357的上游，且與PmCH1357遺傳距離相對較遠，分別為11.3、12.8和35.0 cM，單獨使用1個標記篩選獲得的純合抗病株系數(shù)量分別為54、54和41個，而使用下游遺傳距離最近的標記Xcfd81與這3個標記組合篩選時，獲得的純合抗病株系數(shù)量分別為53、52和38個，與單獨使用這3個標記相比無明顯差異。這表明，在使用2個標記組合篩選時，獲得的純合抗病株系數(shù)量受到遺傳距離較遠的標記限制。

表3 8個連鎖標記及不同標記組合的符合率評價Table 3 Evaluation of the selection efficiency with eight markers and their combinations associated with powdery mildew resistance gene PmCH1357

3 討 論

將多個不同的抗病基因聚合到同一優(yōu)良品種或品系中可有效提高品種抗性及抗病持久性[19]，分子標記技術的發(fā)展為小麥抗病基因的聚合提供了有利條件。目前，小麥中與各種性狀相關的分子標記已有大量報道，但這些分子標記大多用于基因的染色體定位，而基因定位是基于特定親本構建的遺傳群體進行的，因此，與該基因連鎖的分子標記大多僅在特定的環(huán)境或遺傳背景中能有效追蹤目標基因的存在，實際應用中分子標記的使用缺乏一定的通用性。例如楊 燕等[20]和張兆萍等[21]分別利用4個與穗發(fā)芽抗性相關的分子標記Vp1B3、MST101、Xgwm155和wmc104對不同品種進行了檢測，楊 燕等[20]認為，MST101和wmc104與穗發(fā)芽抗性不相關，Vp1B3和Xgwm155與穗發(fā)芽抗性相關；而張兆萍等[21]則認為，Xgwm155、MST101與穗發(fā)芽抗性不相關，Vp1B3和wmc104與穗發(fā)芽抗性相關；僅Vp1B3在中國品種中表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的選擇效率。因此，對現(xiàn)有分子標記在不同遺傳背景或品種中的有效性驗證具有十分重要的意義。

本研究對前期在小偃麥衍生品系CH1357中定位的位于染色體5DS上的抗白粉病基因PmCH1357相關的8對分子標記通過晉麥66/CH1357 F2:3家系群體進行了有效性評價。4對分子標記Xcfd81、Xbwm21、Xbwm20和Xbwm25對整個群體檢測的純合抗病基因型與純合表現(xiàn)型符合率均達到93%以上，可用于抗白粉病基因PmCH1357的篩選；標記Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190對群體檢測的純合抗病基因型和純合表現(xiàn)型符合率偏低，原因可能是分子標記與目標基因間的遺傳距離影響分子標記輔助選擇效率[22]，分子標記與目標基因連鎖越緊密，二者間發(fā)生交換重組的概率越低，選擇效率則越高。Peng等[23]認為，分子標記與目標基因間的遺傳距離小于2.0 cM時，標記檢測的準確率及有效性可達到90%以上。三個標記Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190距離目標基因較遠，遺傳距離分別為11.3 cM、12.8 cM和35.0 cM，標記與目標基因間發(fā)生重組的可能性較大，故選擇效率較低；標記Xmp510與目標基因的遺傳距離為5.5 cM，選擇效率卻僅有25.8%，可能因為該標記為顯性標記，不能有效區(qū)分純合和雜合抗病基因型，在育種實踐中存在較大的局限性。

分子標記輔助選擇中通過多對標記的結(jié)合使用，可提高選擇效率和準確性[24-25]。本研究通過對不同標記組合的選擇效率進行分析后發(fā)現(xiàn)，當組合標記位于連鎖基因的同一側(cè)時，表型和基因型的符合率并無明顯增加，純合抗病株系數(shù)量卻有所降低，其原因可能是當標記位于基因同一側(cè)時，同一個重組株系會在不同標記間表現(xiàn)出不同的基因型，遺傳距離近的標記受到遺傳距離遠的標記限制，遺失更多的純合抗病株系，從而降低了標記的選擇效率；但當2個組合標記分別位于基因兩側(cè)時，表型和基因型的符合率顯著提高，不同側(cè)標記組合進行選擇后表型和基因型的符合率基本相同，而獲得的純合抗病株系數(shù)受到遺傳距離較遠的標記的限制。因此，在使用連鎖標記進行輔助選擇的時候，選擇基因兩側(cè)的標記進行組合可獲得較好的選擇效果；為了進一步提高選擇效率，避免遺失更多的有效株系，應盡量選擇與該基因遺傳距離較近的標記。所以，在對抗白粉病基因PmCH1357進行選擇時，使用標記組合Xcfd81+Xbwm8進行篩選可以獲得更高的準確性及更多的有效株系。

總之，現(xiàn)有的分子標記多數(shù)為連鎖標記，擴增帶型反映的是特定基因組區(qū)段的序列特征，并不代表目標基因本身。因此，為了有效提高分子標記選擇的準確性，還需對抗病基因PmCH1357構建高密度的飽和遺傳圖譜，尋找與該抗病基因更為緊密的兩側(cè)標記，或克隆該基因，開發(fā)可直接用于抗病基因選擇的功能標記或共分離標記，以進一步提高分子標記選擇的效率。