張立堅，池 青，杜琳穎，郭利建，李玉蓮，劉香利,3，馬 猛,3，趙惠賢,3

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟(jì)南 250100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥(Triticumaestivum)作為世界三大主要糧食作物之一，其產(chǎn)量直接關(guān)系著世界糧食安全。1992年Vasil等首次獲得轉(zhuǎn)基因小麥[1]，此后許多小麥研究工作者嘗試通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳育種改良[2-3]。目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化主要采用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[3-4]，基因槍法轉(zhuǎn)化效率不高，通常因為外源基因會出現(xiàn)多位點(diǎn)插入整合，導(dǎo)致外源基因沉默[5]；然而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株外源基因插入整合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)較少[2]。外源基因以單拷貝插入整合到受體植物中時，其表達(dá)水平較高且遺傳穩(wěn)定性較好；而外源基因以多拷貝插入整合到受體植物時，其表達(dá)水平很低甚至?xí)?dǎo)致基因沉默，而且目標(biāo)基因的遺傳穩(wěn)定性也較差[6-7]。因此，在小麥轉(zhuǎn)基因研究中，進(jìn)行T0代轉(zhuǎn)基因再生植株外源基因拷貝數(shù)檢測，篩選獲得單拷貝轉(zhuǎn)基因植株是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，該步驟為后續(xù)篩選獲得遺傳穩(wěn)定且高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系奠定了基礎(chǔ)[8]。

檢測轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)最經(jīng)典的方法是Southern印跡雜交(Southern blot)[9]，該方法準(zhǔn)確度較高，但也存在DNA樣品用量大、操作步驟繁瑣、部分檢測步驟還需要放射性同位素等缺陷[10]。針對這些不足，近年來研究者建立了樣品用量少、簡單、快速、靈敏度高和高通量的實時定量PCR(qRCR)方法來檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的拷貝數(shù)[11]。Weng等[12]同時用Southern blot和TaqMan qPCR兩種方法對轉(zhuǎn)基因油菜(Brassicanapus)進(jìn)行外源基因拷貝數(shù)檢測，結(jié)果表明用TaqMan qPCR方法測定的拷貝數(shù)和用Southern blot測定得到的拷貝數(shù)是一致的，從而證明用TaqMan qPCR檢測轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)的方法體系是準(zhǔn)確可靠的。劉振華等[13]以外源脂氧合酶(LOX)抑制基因(Loxi)的轉(zhuǎn)基因小麥株系為材料，用TaqMan qPCR方法快速準(zhǔn)確地測定了其外源基因拷貝數(shù)，同時分析了轉(zhuǎn)基因小麥株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏姆N子LOX活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源Loxi的拷貝數(shù)與種子LOX活性呈負(fù)相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物細(xì)胞內(nèi)一類具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的蛋白質(zhì)，它可以通過與特定基因啟動子區(qū)特定的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控靶標(biāo)基因在生物體內(nèi)的時空表達(dá)[14]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用[15]。Mohammed等[16]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)分別有154個和117個NAC轉(zhuǎn)錄因子成員，這些NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫。在擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員中，CUC1、CUC2和CUC3等基因均參與分生組織和器官邊界的形成[17]；根尖和側(cè)根中高表達(dá)的NAC1基因受吲哚乙酸(IAA)的誘導(dǎo)，能促進(jìn)側(cè)根的形成[18]；擬南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072基因的誘導(dǎo)表達(dá)，可以顯著提高植株的抗旱能力[19-21]。Jiang等[22]發(fā)現(xiàn)在水稻中過表達(dá)OsNAC2，可以顯著影響水稻的株型和產(chǎn)量。

基于全基因組序列信息預(yù)測，Guerin等[23]發(fā)現(xiàn)小麥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族共包含488個成員，在小麥響應(yīng)逆境脅迫等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。Xia等[24]證明TaNAC8對小麥條銹病病原感染和非生物脅迫都有響應(yīng)。Uauy等[25]發(fā)現(xiàn)小麥中調(diào)控衰老的NAC轉(zhuǎn)錄因子可以改善籽粒中蛋白質(zhì)、鋅和鐵的含量。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)TaRNAC1能促使小麥根長和生物量增加，以及抗旱性提高。本課題組克隆得到TaNAC14基因，將TaNAC14與TaRNAC1這兩個基因進(jìn)行序列比對，并在最新小麥基因組序列IWGSC Ref.v1.0[27]進(jìn)行搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TaNAC14(TraesCS2B02G343600)與TaRNAC1(TraesCS2D02G324700)高度相似，達(dá)97.65%，TaNAC14位于小麥B基因組上，TaRNAC1位于小麥D基因組上，二者是來自不同亞基因組的旁系同源基因。小麥miRNA及降解組研究發(fā)現(xiàn)TaNAC14是miRNA164的調(diào)控靶標(biāo)之一，表達(dá)譜分析顯示TaNAC14/TaRNAC1在小麥籽粒發(fā)育時期表達(dá)水平較高(文章尚未發(fā)表)。但是，目前TaNAC14/TaRNAC1在小麥籽粒生長發(fā)育中的生物學(xué)功能尚不清楚。

為了揭示TaNAC14基因在小麥籽粒生長發(fā)育中的生物學(xué)功能，本課題組采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)TaNAC14基因小麥。本研究主要對轉(zhuǎn)基因小麥中插入整合外源基因TaNAC14的拷貝數(shù)進(jìn)行測定，同時對轉(zhuǎn)基因小麥中外源基因的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)水平進(jìn)行分析，旨在篩選出單拷貝、能夠穩(wěn)定遺傳并且能高水平表達(dá)的TaNAC14轉(zhuǎn)基因小麥株系，為后續(xù)TaNAC14的功能研究奠定基礎(chǔ)，為小麥育種提供新的遺傳穩(wěn)定的種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與載體

植物材料為春性小麥JW1(野生型，轉(zhuǎn)基因受體材料)和14個T0代轉(zhuǎn)基因小麥再生植株(通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pCAMBIA3301-P35S-TaNAC14遺傳轉(zhuǎn)化而來)，由濟(jì)南邦迪生物科技有限公司提供。植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-P35S-TaNAC14由本實驗室構(gòu)建，其T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

LB：左邊界；RB：右邊界；35S T：35S終止子；Bar：篩選標(biāo)記基因，通過編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶來增強(qiáng)植株對BASTA的耐受性；Camv35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子；HisTag6×：6×His標(biāo)簽；Nos T：Nos基因終止子。

1.2 儀器與試劑

定量儀器為CFX96實時定量PCR Detection System(BIO-RAD)；2 × Es Taq MasterMix購自康維世紀(jì)生物有限公司；Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(RR390A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(RR820Q)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)均購自大連寶生物有限公司；RNA提取試劑盒(RP3202)購自北京百泰科生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥基因組DNA的提取

采用CTAB法提取三葉期小麥葉片基因組DNA[28]。DNA樣品的濃度利用電泳檢測和分光光度計確定，通過比較波長230 nm吸光值(OD230)、260 nm吸光值(OD260)和280 nm吸光值(OD280)的比值以判斷DNA樣品的純度。

1.3.2 小麥總RNA的提取及cDNA 的合成

取9個T1代陽性植株和野生型JW1的三葉期植株葉片，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃退火5 min，42 ℃延伸30 min，70 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活15 min，獲得 cDNA。

1.3.3 T0代轉(zhuǎn)基因小麥再生植株的鑒定

本研究根據(jù)前期研究的方法[29]，用100 mg·L-1的BASTA溶液均勻涂抹于三葉一心期的野生型小麥JW1和14株T0代轉(zhuǎn)基因小麥的第一片完全展開葉片上，涂抹面積為整個葉片的1/3，于溫室18 ℃培養(yǎng)7 d后觀察植株葉片表型。

因為轉(zhuǎn)基因小麥植株中插入序列含有TaNAC14+Nos(終止子)序列，而TaNAC14來自于小麥本身，所以本研究以目標(biāo)基因TaNAC14之后的Nos序列為PCR擴(kuò)增的目標(biāo)序列，對T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定。用Primer 5.0設(shè)計序列特異引物，進(jìn)行序列特異PCR擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)基因小麥再生植株中的陽性植株，引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成(表1)。目的片段長度為192 bp。PCR反應(yīng)體系為：2×Es Taq MasterMix 0.2 μL，上游引物Nos-F(10 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物Nos-R(10 μmol·L-1)0.5 μL，模板(50 ng·μL-1)2 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，核酸染料染色，用凝膠成像儀觀察。比較BASTA涂抹和PCR結(jié)果，統(tǒng)計T0代轉(zhuǎn)基因小麥陽性植株和陰性植株的數(shù)量。

表1 TaNAC14基因的探針引物和定量引物信息

1.3.4 TaqMan qPCR擴(kuò)增

以小麥內(nèi)源控制籽粒硬度的主效單拷貝基因Pinb(Puroindolineb，GenBank登錄號：LOC543301)為內(nèi)參基因，以轉(zhuǎn)基因小麥植株中目標(biāo)基因TaNAC14之后的Nos序列為外源目標(biāo)序列進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增。內(nèi)參基因和外源目標(biāo)序列的探針引物設(shè)計通過IDT(Integrated DNA Technologies)網(wǎng)站中Primer Quest Tool設(shè)計(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)，由Invitrogen公司(上海)合成(表1)；普通引物采用Primer 5.0進(jìn)行設(shè)計分析，由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系為：2 × Premix Ex Taq 12.5 μL，模板(50 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，TaqMan探針(5 μmol·L-1)1.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s， 60 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.3.5 內(nèi)參基因Pinb和外源序列Nos擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以野生型小麥JW1為陰性對照，ddH2O為空白對照，以5倍梯度稀釋的轉(zhuǎn)基因植株TaNAC14-3的基因組DNA為模板進(jìn)行qPCR，設(shè)置3個重復(fù)，獲得不同濃度模板的Ct值，根據(jù)不同濃度模板對應(yīng)的Ct值與其濃度對數(shù)值LogC0(C0為qPCR的起始濃度) 之間的關(guān)系分別建立Pinb和Nos的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 T0代轉(zhuǎn)基因小麥再生植株中外源序列Nos拷貝數(shù)的檢測

轉(zhuǎn)基因小麥外源目標(biāo)基因拷貝數(shù)的測定參考Weng等[12]的方法。

拷貝數(shù)計算公式：

X0/R0=10[(Ctx-Ix)/Sx-(CtR-IR)/SR]，其中X0和R0分別為外源序列Nos和內(nèi)參基因Pinb的拷貝數(shù)，CtX和CtR分別為外源序列Nos和內(nèi)參基因Pinb的PCR擴(kuò)增熒光量達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)，IX與IR分別為外源序列Nos和Pinb標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SX和SR分別為外源序列Nos和內(nèi)參基因Pinb標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。本研究采用的內(nèi)參基因Pinb為小麥中的單拷貝純合基因，因此公式中的R0為2。

1.3.7 單拷貝轉(zhuǎn)基因小麥再生植株T0:1代株系轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性分析

將上述鑒定的T0代單拷貝轉(zhuǎn)基因小麥植株收獲的種子在溫室中加代種植，獲得T1代轉(zhuǎn)基因小麥株系。將100 mg·L-1的BASTA溶液均勻涂抹于三葉一心期的野生型小麥和T1代轉(zhuǎn)基因小麥植株完全展開葉片，鑒定和統(tǒng)計T1代轉(zhuǎn)基因陽性和陰性植株數(shù)目，分析轉(zhuǎn)基因小麥T0:1代株系轉(zhuǎn)基因的遺傳情況。

1.3.8 T1代轉(zhuǎn)基因小麥株系目的基因表達(dá)水平測定

以9株T1代陽性植株和野生型JW1的cDNA為模板，通過qPCR來檢測目標(biāo)基因的表達(dá)水平，以小麥β-actin(GenBank登錄號：MF405765.1)基因作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理。qPCR以野生型小麥JW1為陰性對照，ddH2O作為空白對照，每個樣品設(shè)置3個獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。檢測引物NAC14-F、NAC14-R、ACTIN-F和ACTIN-R采用Primer 5.0進(jìn)行設(shè)計，由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系：2×TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，45個循環(huán)。每管PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性由儀器記錄的溶解曲線證實。采集分析各樣品的Ct值，各樣品中目標(biāo)基因相對表達(dá)水平按照改良的2-△△Ct方法[30]計算。用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因小麥再生植株鑒定結(jié)果

用100 mg·L-1的BASTA溶液均勻涂抹于三葉一心期的野生型小麥JW1和14個轉(zhuǎn)基因小麥T0代再生植株的第一片完全展開葉片，7 d后觀察葉片表型。野生型小麥JW1和部分轉(zhuǎn)基因再生植株的表型如圖2所示，野生型小麥JW1涂抹BASTA溶液后葉片發(fā)黃枯萎，轉(zhuǎn)基因再生植株中有5株(TaNAC14-2、TaNAC14-6、TaNAC14-7、TaNAC14-8和TaNAC14-11)表型與野生型JW1相同，即涂抹葉片發(fā)黃枯萎，表明它們?yōu)檗D(zhuǎn)基因陰性植株；其他9株再生植株涂抹BASTA溶液后葉片無明顯變化，表明這些植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

JW1：野生型；TaNAC14-2：轉(zhuǎn)基因陰性； TaNAC14-3：轉(zhuǎn)基因陽性；JW1和TaNAC14-2葉片變黃枯萎；TaNAC14-3葉片無明顯變化。

進(jìn)一步以野生型JW1和14株T0代轉(zhuǎn)基因再生植株的基因組DNA為模板，進(jìn)行目標(biāo)序列特異PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示陽性對照pCAMBIA3301質(zhì)粒和上述9株轉(zhuǎn)基因陽性植株均能擴(kuò)增出大小為192 bp的目的條帶，而空白對照(水)、陰性對照野生型小麥JW1和5株轉(zhuǎn)基因陰性植株均沒有相應(yīng)的擴(kuò)增條帶(圖3)。

M：Marker DL2000；H2O：ddH2O；N：陰性對照J(rèn)W1；P：陽性對照pCAMBIA3301質(zhì)粒；1～14：轉(zhuǎn)基因植株TaNAC14-1～TaNAC14-14。

總之，BASTA溶液涂抹和目標(biāo)序列特異PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果完全一致，14個轉(zhuǎn)TaNAC14基因小麥的T0代再生植株中有9個為轉(zhuǎn)基因陽性株系。

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因小麥再生植株外源序列拷貝數(shù)檢測結(jié)果

2.2.1 TaqMan qPCR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以轉(zhuǎn)基因植株TaNAC14-3基因組DNA的5倍系列稀釋液作為模板，分別用內(nèi)參基因Pihb和目標(biāo)序列Nos的特異引物和探針引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

以LogC0為X軸，C0相對應(yīng)的Ct值為Y軸，分別建立Pinb和Nos的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4A和4B)。由圖4可以看出，內(nèi)參基因Pinb擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-3.139x+35.142，R2= 0.998，縱軸截距IR=35.142，斜率SR= -3.139，PCR擴(kuò)增效率為107.9%(圖4A)。外源序列Nos擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.109x+31.705，R2= 0.999，縱軸截距IX=31.705，斜率SX= -3.109，PCR擴(kuò)增效率為108.9%(圖4B)。這兩個擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為 0.998和0.999，都接近于1，表明得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠用于檢測T0代轉(zhuǎn)基因小麥植株目標(biāo)基因拷貝數(shù)。

圖4 內(nèi)參基因Pinb(A)和外源序列Nos(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 T0代轉(zhuǎn)基因小麥植株外源序列的拷貝數(shù)

以9株T0代轉(zhuǎn)基因小麥陽性植株基因組DNA為模板，分別用內(nèi)參基因Pinb和外源序列Nos的特異引物和探針進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增，得到的外源序列和內(nèi)參基因擴(kuò)增的Ct值見表2。各轉(zhuǎn)基因小麥植株的外源序列拷貝數(shù)X0計算結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，9個T0代轉(zhuǎn)基因小麥陽性株系中有5個為轉(zhuǎn)基因單拷貝，4個為雙拷貝。

表2 T0代轉(zhuǎn)基因小麥植株外源序列拷貝數(shù)

2.3 外源基因單拷貝插入整合的小麥T0:1株系轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性

由于轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)率低且植株生長狀況不佳，僅獲得2個T0:1株系TaNAC14-3(7株)和TaNAC14-9(4株)。采用BASTA涂抹方法鑒定這2個T0:1代小麥株系所有T1代植株轉(zhuǎn)基因陽性與陰性植株的數(shù)量(表3)，結(jié)果表明，TaNAC14-3的7株T1代轉(zhuǎn)基因植株中有5株(TaNAC14-3-1、TaNAC14-3-2、TaNAC14-3-3、TaNAC14-3-5、TaNAC14-3-6)為陽性，TaNAC14-9的4株T1代轉(zhuǎn)基因植株中有2株(TaNAC14-9-1、TaNAC14-9-2)為陽性。這表明本研究得到的外源目標(biāo)基因TaNAC14是可遺傳的。

表3 T0:1轉(zhuǎn)基因小麥株系目標(biāo)基因的遺傳穩(wěn)定性分析

2.4 T1代轉(zhuǎn)基因小麥植株目標(biāo)基因的表達(dá)量

用RT-qPCR方法，分別對上述得到的7個T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株和野生型JW1葉片目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行測定。結(jié)果(表4)表明，與對照J(rèn)W1相比，各轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因TaNAC14表達(dá)量均極顯著增加，并且2個株系的每個植株間的表達(dá)水平存在一定的差異。

表4 轉(zhuǎn)基因小麥植株目標(biāo)基因 TaNAC14的表達(dá)水平

3 討 論

前人研究報道轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體上Nos終止子序列的檢測結(jié)果可被用作判斷轉(zhuǎn)基因作物的主要依據(jù)[32-33]。因此，通過檢測Nos終止子序列的拷貝數(shù)來確定T0代轉(zhuǎn)基因小麥植株中插入整合的外源基因拷貝數(shù)是可信的。在小麥遺傳改良過程中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因植株，外源目標(biāo)基因常以低拷貝隨機(jī)插入整合到受體植株中，這有利于外源目標(biāo)基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因植株的功能研究和育種應(yīng)用提供了條件[34]。本研究利用TaNAC14基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對小麥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過篩選標(biāo)記基因和目標(biāo)序列特異PCR方法鑒定獲得了9株T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株，其中5株為單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，4株為雙拷貝，單拷貝插入整合的比率接近 55.6%。

轉(zhuǎn)基因功能研究或轉(zhuǎn)基因作物育種的前提是外源基因能夠插入整合至受體基因組中，而且能高水平表達(dá)和穩(wěn)定遺傳。本研究對獲得的單拷貝插入整合的T0代小麥轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株在溫室進(jìn)行加代繁殖，獲得了T1代轉(zhuǎn)基因小麥過表達(dá)株系。在此基礎(chǔ)上，本研究對T0:1代TaNAC14轉(zhuǎn)基因小麥株系的目標(biāo)基因遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示T0代轉(zhuǎn)基因植株TaNAC14-3和TaNAC14-9的目標(biāo)基因均遺傳至T1代；進(jìn)一步用RT-qPCR對T1代轉(zhuǎn)基因小麥植株中目標(biāo)基因TaNAC14的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株TaNAC14的表達(dá)量均極顯著高于野生型。這說明本研究獲得了目標(biāo)基因TaNAC14能夠穩(wěn)定遺傳而且高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥株系，這為后續(xù)TaNAC14基因的生物功能研究提供了基礎(chǔ)材料。本研究計劃后期對TaNAC14的轉(zhuǎn)基因小麥株系繼續(xù)加代繁殖和篩選鑒定，以期獲得純合的轉(zhuǎn)基因小麥株系，進(jìn)而研究TaNAC14基因?qū)π←溕L發(fā)育和產(chǎn)量性狀的影響。

4 結(jié) 論

本研究采用BASTA涂抹和PCR檢測相結(jié)合的方法，從14株T0代TaNAC14轉(zhuǎn)基因再生植株中鑒定出9株陽性植株；用TaqMan qPCR方法檢測了9株T0代轉(zhuǎn)基因陽性小麥植株外源基因的拷貝數(shù)，得到5株單拷貝轉(zhuǎn)基因植株。對這些單拷貝轉(zhuǎn)基因植株的T0:1株系目標(biāo)基因的遺傳情況進(jìn)行分析，表明TaNAC14是可遺傳的。對T1代轉(zhuǎn)基因小麥株系目標(biāo)基因TaNAC14表達(dá)水平進(jìn)行測定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小麥中TaNAC14的表達(dá)水平與野生型相比，顯著增加。本研究獲得的可遺傳且高水平表達(dá)的TaNAC14轉(zhuǎn)基因小麥株系為后續(xù)該目標(biāo)基因的功能研究奠定了重要基礎(chǔ)。