文/徐日俊 顧澤茂 李莉娟 袁軍法

為了探究不同養(yǎng)殖模式下小龍蝦感染W(wǎng)SSV的現(xiàn)狀和養(yǎng)殖環(huán)境因素對(duì)WSSV發(fā)生的影響，作者對(duì)湖北省小龍蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了WSSV流行病學(xué)調(diào)查，并定點(diǎn)監(jiān)測(cè)了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)基地（潛江市、武漢蔡甸區(qū)）的WSSV感染規(guī)律。結(jié)果顯示：湖北省養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)總體帶毒率為51.65%，其中池塘為55.29%，稻田為47.60%；正常塘為20.81%，發(fā)病塘為72.82%。定點(diǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示池塘養(yǎng)殖模式的小龍蝦帶毒率和病毒載量顯著高于稻田模式（P＜0.05）。比較發(fā)病塘與正常塘的水質(zhì)環(huán)境因子，結(jié)果顯示正常塘的各水質(zhì)指標(biāo)較為穩(wěn)定，發(fā)病塘的各水質(zhì)指標(biāo)更為離散。說(shuō)明不同養(yǎng)殖模式的WSSV流行規(guī)律存在顯著差異，同水環(huán)境質(zhì)量直接相關(guān)，研究結(jié)果為WSSV的環(huán)境發(fā)生機(jī)制研究和生態(tài)防控策略制定提供了科學(xué)依據(jù)。

小龍蝦，學(xué)名為克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），分類(lèi)學(xué)上隸屬甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬。小龍蝦為美國(guó)中南部和墨西哥北部的土著物種，二十世紀(jì)三十年代末由日本傳入我國(guó)，目前已廣泛分布于全國(guó)21個(gè)省份，并逐漸歸化為自然水域的一個(gè)物種，成為我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖對(duì)象。2018年我國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)163.87萬(wàn)噸，其中湖北省產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的一半。隨著小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，養(yǎng)殖過(guò)程中小龍蝦疾病的危害日益嚴(yán)重，尤其是白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）給養(yǎng)殖業(yè)者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

WSSV為雙鏈DNA病毒，屬線性病毒科（Nimaviridae）、白斑病毒屬（Whispovirus）。該病毒最早在1992年發(fā)現(xiàn)于臺(tái)灣對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)域，并迅速散播至整個(gè)東南亞地區(qū)，進(jìn)而在全球?qū)ξr養(yǎng)殖區(qū)蔓延，目前WSSV已成為全球甲殼類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的最大威脅。WSSV宿主廣泛，對(duì)小龍蝦易感，患病小龍蝦表現(xiàn)為體色發(fā)暗、攝食減少、活力下降、反應(yīng)遲鈍，部分靜臥于池邊水草上，但并不在甲殼上形成白斑。WSSV已被廣泛研究，涉及流行病學(xué)、致病機(jī)理、宿主免疫應(yīng)答和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制等方面，但在養(yǎng)殖水環(huán)境同WSSV關(guān)聯(lián)機(jī)制領(lǐng)域研究較少，尤其是養(yǎng)殖水環(huán)境與小龍蝦WSSV發(fā)生的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前小龍蝦的集約化養(yǎng)殖模式主要有稻田養(yǎng)殖和池塘養(yǎng)殖兩種。稻田養(yǎng)殖是一種充分利用水稻插秧、管理與收割的特點(diǎn)，配套進(jìn)行小龍蝦養(yǎng)殖的“雙水雙綠”養(yǎng)殖模式；池塘養(yǎng)殖是一種傳統(tǒng)的高密度養(yǎng)殖模式。兩種養(yǎng)殖模式的水環(huán)境差別較大，其水質(zhì)管理措施也截然不同。鑒于尚無(wú)對(duì)抗WSSV的有效藥物，水質(zhì)調(diào)控和生態(tài)操控等綜合防控措施在WSSV防控中至關(guān)重要。為探究不同養(yǎng)殖模式的環(huán)境差異對(duì)小龍蝦感染W(wǎng)SSV的影響，本研究擬通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查和定點(diǎn)監(jiān)測(cè)分析不同小龍蝦養(yǎng)殖模式中WSSV的流行規(guī)律，探究小龍蝦白斑綜合征發(fā)生的主要環(huán)境誘因，為小龍蝦白斑綜合征的預(yù)警和生態(tài)防控提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）樣品采集

2017年7月～2019年6月期間，從湖北省武漢、漢川、蔡甸、公安、黃岡、孝感、咸寧、潛江、仙桃、洪湖、監(jiān)利等小龍蝦養(yǎng)殖地區(qū)，隨機(jī)選擇池塘、稻田養(yǎng)殖模式的正常塘和發(fā)病塘，每種模式選擇3個(gè)以上池塘，每個(gè)塘采集10尾以上小龍蝦進(jìn)行檢測(cè)。取蝦鰓保存在2.0mL離心管中，放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?。選擇位于潛江市和武漢市蔡甸區(qū)的小龍蝦實(shí)驗(yàn)基地作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，分別選擇池塘養(yǎng)殖、稻田養(yǎng)殖模式各3口塘，每口塘采集10只蝦，取鰓用于檢測(cè)。

（二）水質(zhì)檢測(cè)

使用多參數(shù)水質(zhì)分析儀（HQ40D，Hach Loveland，USA）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溶解氧（DO）、電導(dǎo)率（EC）、氧化還原電位（ORP）和pH值，以水產(chǎn)養(yǎng)殖儀（DZB）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定氨氮、亞硝態(tài)氮和硫化氫。

（三）組織DNA提取

取25mg鰓組織，按照基因組提取試劑盒操作提取組織總DNA，保存于-20℃冰箱備用。

（四）病毒檢測(cè)

以靶向于WSSV DNA聚合酶的特異性引物WDP06/07，擴(kuò)增理論目的片段大小330bp，引物序列如下：

PCR反應(yīng)體系為25μL：10×Easy Taq Buffer2.5μL；dNTPs（2.5 mmol/L）2.0μL；Easy Taq（0.5U/μL）0.1μL；WDP06（10μmol/L）1.0μL；WDP07（10μmol/L）1.0μL；Template DNA1.0μL；滅菌三蒸水17.4μL。Realtime PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix 10μL、正反向引物各0.5μL（10μmol/L）、模板1.0μL、雙蒸水8.0μL，總體積為20.0μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means±SE）表示。

二、結(jié)果

（一）養(yǎng)殖小龍蝦攜帶WSSV的調(diào)查

本實(shí)驗(yàn)共采集484尾養(yǎng)殖小龍蝦，其中發(fā)病池塘樣品287尾，正常池塘樣品197尾。以PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示采集的小龍蝦帶毒率為51.65%。分析不同養(yǎng)殖狀態(tài)的池塘樣本帶毒率，結(jié)果顯示正常池塘帶毒率為20.81%，而發(fā)病池塘的帶毒率為72.82%。不同養(yǎng)殖類(lèi)型的小龍蝦帶毒率分析顯示池塘養(yǎng)殖模式中小龍蝦帶毒率為55.29%，稻田養(yǎng)殖模式中小龍蝦帶毒率為47.60%。詳見(jiàn)圖1。

（二）養(yǎng)殖小龍蝦攜帶WSSV的定點(diǎn)監(jiān)測(cè)

為了驗(yàn)證不同養(yǎng)殖模式下小龍蝦攜帶WSSV的規(guī)律，選擇潛江和蔡甸兩個(gè)小龍蝦實(shí)驗(yàn)基地，調(diào)查4月～6月不同養(yǎng)殖模式下的小龍蝦帶毒率及病毒載量。結(jié)果顯示，4月～6月蔡甸基地池塘養(yǎng)殖小龍蝦帶毒率為57.78%，稻田養(yǎng)殖模式小龍蝦帶毒率為48.89%；潛江基地池塘養(yǎng)殖小龍蝦帶毒率68.89%，稻田養(yǎng)殖模式小龍蝦帶毒率47.78%。詳見(jiàn)圖2。對(duì)兩種養(yǎng)殖模式的病毒載量分析發(fā)現(xiàn)，池塘養(yǎng)殖模式的小龍蝦攜帶WSSV的載量范圍為102copies/μg～1010copies/μg DNA，而稻田養(yǎng)殖模式的載量范圍為103copies/μg～108copies/μg DNA之間，其病毒載量中位數(shù)低于池塘養(yǎng)殖。

表1 養(yǎng)殖狀態(tài)對(duì)水質(zhì)指標(biāo)的影響

（三）WSSV發(fā)生的水質(zhì)環(huán)境因子調(diào)查

為了調(diào)查WSSV發(fā)生的環(huán)境誘因，選擇20個(gè)小龍蝦發(fā)病塘、14個(gè)小龍蝦正常塘，比較兩者的水質(zhì)指標(biāo)，包括溶解氧、酸堿度、電導(dǎo)率、氧化還原電位、氨氮、亞硝態(tài)氮、硫化氫等共7個(gè)指標(biāo)。結(jié)果顯示，發(fā)病塘中的溶解氧、氧化還原電位、氨氮、亞硝態(tài)氮和pH值較正常塘更為離散。其中發(fā)病塘的溶解氧和氧化還原電位顯著偏低，而氨氮和亞硝態(tài)氮顯著偏高。兩者之間的電導(dǎo)率和硫化氫無(wú)顯著性差異。詳見(jiàn)表1。

（四）不同養(yǎng)殖模式水質(zhì)指標(biāo)的比較

為了驗(yàn)證WSSV發(fā)生與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)，選擇潛江和蔡甸兩個(gè)小龍蝦實(shí)驗(yàn)基地調(diào)查不同養(yǎng)殖模式的水質(zhì)指標(biāo)。結(jié)果顯示，蔡甸實(shí)驗(yàn)基地4月～6月池塘和稻田養(yǎng)殖模式中的溶氧等水質(zhì)指標(biāo)呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，而池塘養(yǎng)殖模式較稻田養(yǎng)殖的溶氧低，氨氮、亞硝態(tài)氮指標(biāo)偏高。潛江實(shí)驗(yàn)基地呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，其酸堿度、電導(dǎo)率和氧化還原電位沒(méi)有明顯變化。詳見(jiàn)表2。

三、討論

小龍蝦的主要養(yǎng)殖模式分稻田與池塘養(yǎng)殖兩種，其養(yǎng)殖管理、水環(huán)境和產(chǎn)量存在明顯差異。本研究的結(jié)果表明不同養(yǎng)殖模式的WSSV流行規(guī)律和水質(zhì)因子也存在顯著差異，為WSSV的環(huán)境發(fā)生機(jī)制研究和生態(tài)防控策略制定提供了依據(jù)。

流行病學(xué)調(diào)查顯示W(wǎng)SSV是小龍蝦養(yǎng)殖的主要威脅，蘭江風(fēng)等研究顯示湖北5個(gè)養(yǎng)殖區(qū)小龍蝦的帶毒率超過(guò)80%，李青彬等發(fā)現(xiàn)小龍蝦的感染率為52.77%。本研究發(fā)現(xiàn)湖北省10個(gè)養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)的養(yǎng)殖小龍蝦的帶毒率為51.65%。因采樣范圍、季節(jié)及WSSV檢測(cè)方法的不同，不同研究者的流調(diào)結(jié)果也差異較大，但都表明了養(yǎng)殖的小龍蝦攜帶WSSV較為普遍。其它養(yǎng)殖地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查也呈現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。此外，采集自正常養(yǎng)殖塘的小龍蝦帶毒率為14.49%，定點(diǎn)監(jiān)測(cè)也發(fā)現(xiàn)未發(fā)病的小龍蝦攜帶WSSV的情況，呈“帶毒不發(fā)病”狀態(tài)。先前劉波等通過(guò)人工感染日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）復(fù)制出“帶毒不發(fā)病”的類(lèi)似狀態(tài)。這些研究提示W(wǎng)SSV或可建立持續(xù)性感染。鑒于養(yǎng)殖小龍蝦普遍帶毒及“帶毒不發(fā)病”的現(xiàn)狀，建立小龍蝦白斑病的預(yù)警機(jī)制，降低發(fā)病率和提高養(yǎng)成率將是小龍蝦養(yǎng)殖管理的首要問(wèn)題。

表2 不同養(yǎng)殖模式的水質(zhì)指標(biāo)

4月～6月是小龍蝦白斑病發(fā)生的高峰，流行病學(xué)調(diào)查顯示5月份帶毒率高達(dá)70%，提示W(wǎng)SSV是引發(fā)小龍蝦“五月瘟”的主要病原。然后從發(fā)病塘的檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看，有近30%的發(fā)病蝦并未檢出WSSV，提示其它病原對(duì)小龍蝦的危害也不容忽視。New等發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬能夠造成小龍蝦的大量死亡，付應(yīng)三等在發(fā)病小龍蝦體內(nèi)分離到副溶血弧菌，這些都提示正確診斷、采取合理的應(yīng)對(duì)措施對(duì)小龍蝦病害的防控十分重要。

針對(duì)南美白對(duì)蝦的研究顯示環(huán)境脅迫會(huì)改變蝦的先天免疫，增強(qiáng)WSSV的復(fù)制。如氨氮脅迫可以激活南美白對(duì)蝦的IRE1-XBP1信號(hào)通路，激活的XBP1s作為分子伴侶參與WSSV基因wsv023/wsv069，wsv083和wsv059/wsv166的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，增強(qiáng)病毒復(fù)制。低氧脅迫降低了南美白對(duì)蝦的鐵蛋白、羧肽酶A2和鋅蛋白酶Mpc1的表達(dá)，受脅迫的對(duì)蝦更易受到WSSV的侵襲。亞硝態(tài)氮暴露也可減低對(duì)蝦血pH、氧合血藍(lán)蛋白和血藍(lán)蛋白濃度降低，會(huì)產(chǎn)生“低氧脅迫”效應(yīng)，利于WSSV在蝦體內(nèi)的增殖。而小龍蝦與對(duì)蝦同屬于甲殼綱，十足目，生物學(xué)和遺傳學(xué)存在諸多相似地方，本研究顯示小龍蝦發(fā)病塘的溶氧、氨氮和亞硝態(tài)氮顯著偏低，這些結(jié)果說(shuō)明池塘環(huán)境因子變化所致的環(huán)境脅迫同小龍蝦白斑病的發(fā)生直接相關(guān)，為通過(guò)環(huán)境調(diào)節(jié)和生態(tài)操控防控小龍蝦WSSV提供了理論依據(jù)。

流行病學(xué)調(diào)查和定點(diǎn)監(jiān)測(cè)都顯示稻田養(yǎng)殖模式的小龍蝦帶毒率要明顯低于池塘養(yǎng)殖的小龍蝦，與養(yǎng)殖戶反饋的稻田養(yǎng)殖的小龍蝦發(fā)病率要低于池塘的現(xiàn)象一致。水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)顯示4月～6月稻田養(yǎng)殖模式較池塘養(yǎng)殖模式的溶氧更高、氨氮和亞硝態(tài)氮水平更低，有助于降低養(yǎng)殖小龍蝦的環(huán)境脅迫。而張啟發(fā)等提出利用稻田資源，采用綠色新技術(shù)和新品種，通過(guò)稻田種養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)水稻、水產(chǎn)協(xié)同發(fā)展（雙水），生產(chǎn)綠色稻米、綠色水產(chǎn)品（雙綠）的產(chǎn)業(yè)發(fā)展模式為新時(shí)期的蝦稻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)提供了新的藍(lán)本。

溶氧、pH及氨氮等環(huán)境因素同WSSV的發(fā)生直接相關(guān)，為建立基于環(huán)境因子的WSSV預(yù)警系統(tǒng)提供了理論依據(jù)。現(xiàn)階段，小龍蝦消費(fèi)市場(chǎng)的快速發(fā)展吸引了眾多的新興投資者，百畝以上的規(guī)模養(yǎng)殖企業(yè)成為小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)的主導(dǎo)者，千畝連片的養(yǎng)殖基地也較常見(jiàn)，為小龍蝦的智能化養(yǎng)殖管理提供了可能。本研究的結(jié)果表明溶解氧、氨氮、亞硝態(tài)氮等水環(huán)境指標(biāo)可作為WSSV發(fā)生的預(yù)警因子。通過(guò)在線監(jiān)測(cè)溶氧等相關(guān)水質(zhì)環(huán)境因子，結(jié)合小龍蝦攜帶WSSV的檢測(cè)，建立WSSV發(fā)生的預(yù)警系統(tǒng)，可及早采取干預(yù)措施，降低小龍蝦的發(fā)病率。此外后期還可通過(guò)大數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證來(lái)確定誘導(dǎo)WSSV發(fā)生的環(huán)境因子閾值，通過(guò)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型來(lái)建立WSSV暴發(fā)預(yù)警系統(tǒng)。