蔡雪梅，易宇文，喬明鋒，何 蓮，鄧 靜，彭毅秦

（四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610100）

辣椒由于其鮮艷的顏色、復(fù)雜的辛辣味和香氣以及抗氧化、鎮(zhèn)痛等功效，在全世界都被廣泛食用。不同品種的辣椒物理性質(zhì)、風(fēng)味特點(diǎn)、抗氧化能力等都存在一定差異[1]。小米椒是辣椒的一種，個(gè)體較小，紅帶橙色。小米椒發(fā)酵制品是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品之一，其風(fēng)味獨(dú)特，酸辣可口，能促進(jìn)食欲，同時(shí)還有防腐抗氧化等功能[2-4]。

辛辣味是辣椒制品最主要的屬性之一，但是揮發(fā)性化合物與辣椒風(fēng)味息息相關(guān)，風(fēng)味是辣椒及其制品品質(zhì)的重要內(nèi)容，且消費(fèi)者接受食物的主要選擇標(biāo)準(zhǔn)之一就是風(fēng)味，因此對辣椒及其制品的揮發(fā)性化合物的研究至關(guān)重要，探索辣椒發(fā)酵過程中主要香氣貢獻(xiàn)物的形成與變化可為生產(chǎn)工藝的調(diào)控提供有價(jià)值的信息[5]。成熟的小米椒主要揮發(fā)性化合物是酯類和萜烯類化合物，主要包括4-methylpentyl 5-methylpentanoate、4-甲基戊基2-甲基丁酸酯、3-甲基丁酸甲酯、（R）-檸檬烯、萜品烯等，賦予小米椒柑橘香、甜香和果香[6]。巴西辣椒也是以果香為主，但不同品種的巴西辣椒主要揮發(fā)性化合物存在差異，Malagueta辣椒以酯類為主，Murupi辣椒倍半萜類物質(zhì)為主，Dedo-de-mo?a辣椒則以醛類和甲氧基吡嗪類為主[7]。辣椒經(jīng)過不同的處理風(fēng)味也會(huì)存在差異，煙熏的辣椒具有較為強(qiáng)烈的煙熏香氣味，品質(zhì)較高，與之相關(guān)的物質(zhì)主要是酯類和醇類，烘干的辣椒保留水果香，以醛類為主，曬干的辣椒有稻草香，品質(zhì)較低[8]。除辣椒干制外，辣椒發(fā)酵也是常見的辣椒加工方式，其能保持鮮椒口感，又耐貯藏。不同品種辣椒發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)差異較大，黃平線椒以酯類物質(zhì)；施秉線椒和大方皺椒以醇類物質(zhì)相對含量最高；百宜平面椒和花溪黨武辣椒以烴類為主[9]。在發(fā)酵過程中辣椒的風(fēng)味也會(huì)發(fā)生變化，朝天椒剁辣椒在自然發(fā)酵前后最主要的風(fēng)味成分都是烯烴類化合物，但是發(fā)酵過程中酯類和酸類物質(zhì)相對含量都顯著增加[10-11]。

目前辣椒的發(fā)酵多采用自然發(fā)酵，風(fēng)味受影響因素較多，難以推測其變化機(jī)理。因此本課題將小米椒進(jìn)行恒溫發(fā)酵，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）對小米椒發(fā)酵過程中不同時(shí)期香氣物質(zhì)組成進(jìn)行分析，研究發(fā)酵小米椒在制作過程中香氣物質(zhì)組成的變化，以及香氣成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為小米椒的發(fā)酵工藝優(yōu)化、品質(zhì)保證以及發(fā)酵過程中風(fēng)味調(diào)控提供理論科學(xué)依據(jù)，同時(shí)，該研究對在工業(yè)生產(chǎn)中恒溫條件下控制發(fā)酵時(shí)間獲得發(fā)酵小米椒的最佳風(fēng)味具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米椒、大蒜、蔗糖、食用鹽、純凈水、白醋、味精：市售。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BT423S型電子天平：德國賽多利斯公司；SQ8/Clarus 680氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Per-kinElmer公司；57318 CAR/PDMS（75 μm）萃取頭、Supelco手動(dòng)固相微萃取裝置：美國Supelco公司；15 mL頂空瓶：北京譜朋科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照易宇文等[3]的發(fā)酵方法，選取清洗干凈無破損的小米椒置于發(fā)酵壇中，加入2%蔗糖、10%食鹽、6%醋、0.2%味精、0.5%大蒜以及純凈水，攪拌均勻，密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵16 d，每隔2 d取樣。所取樣品裝于取樣袋中，置于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 感官評價(jià)

挑選有品評經(jīng)驗(yàn)的14名食品專業(yè)學(xué)生（7男7女）組成品評小組，參照參考文獻(xiàn)[2]的方法，從色澤、體態(tài)、香味、質(zhì)感和滋味五個(gè)方面進(jìn)行感官評分。品評員評分時(shí)，在口中充分咀嚼后咽入，每個(gè)樣品重復(fù)評價(jià)3次，每次品嘗前后用溫水漱口。

1.3.3 氣相色譜質(zhì)譜分析

參照KANG K M等[12]的方法，并略作改動(dòng)。頂空條件：稱取4 g搗碎的小米椒于15 mL頂空瓶中，平衡溫度70 ℃，時(shí)間30 min，然后將老化（250 ℃，10 min）的萃取頭（75 μm CAR/PDMS）插入頂空瓶中吸附30 min，再將萃取針頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，250 ℃條件下解吸4 min。

氣相條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；色譜柱Elite-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持3min。載氣：氦氣（He）（純度99.999 9%），流速1 mL/min，分流比10∶1。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲1 min；全掃描；質(zhì)量掃描范圍：33～500 m/z；標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧文件。

定性與定量分析：將質(zhì)譜圖與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）2011版標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對照，正反匹配度均＞700，并比對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行確定，定量分析采用峰面積歸一化法。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

用軟件Excel、SPSS 20.0、Origin 8.5和HemI進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價(jià)分析

小米椒發(fā)酵過程中感官變化見圖1。

圖1 小米椒發(fā)酵過程中感官評分雷達(dá)圖Fig.1 Radar plot of sensory score of shimatogarashi during the fermentation

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，小米椒的色澤評分先降后增，新鮮小米椒顏色鮮艷，發(fā)酵中色素可能分解，而在微生物的作用下又會(huì)產(chǎn)生新的變化；而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，小米椒的體態(tài)和質(zhì)感變化不顯著，在發(fā)酵起始，小米椒的形態(tài)最完整，脆度最好；小米椒香味和滋味都在14 d達(dá)到最高，發(fā)酵香氣濃郁，酸辣味純正柔和，口感協(xié)調(diào)，在16 d有所下降，因此設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為16 d，來研究此段發(fā)酵時(shí)間里小米椒的風(fēng)味物質(zhì)的變化。

2.2 小米椒發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分種類的變化

9個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間的小米椒經(jīng)GC-MS檢測共鑒定出144種揮發(fā)性成分，包括29種酯、48種烴、25種醇、8種酮、17種醛、4種酚、3種呋喃、4種含氮類、9種含硫類和1種酸，每類物質(zhì)的相對含量和數(shù)量見表1。發(fā)酵辣椒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量主要取決于辣椒品種以及發(fā)酵工藝。歐陽晶等[11]以壇壇香4號(hào)紅線椒為原料進(jìn)行高鹽發(fā)酵，在高鹽發(fā)酵辣椒中共檢測到66種化合物，其中酯類最多，有18種；路寬等[9]的研究表明，不同品種辣椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分差異較大。小米椒在發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分種類和數(shù)量都在發(fā)生變化。在發(fā)酵初期，小米椒含有66種物質(zhì)，相對總含量78.23%，其中最主要的是烴類化合物，成熟的小米椒中萜烯類化合物占主要部分[6]；其次是酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)；發(fā)酵初期沒有呋喃類和含氮類物質(zhì)，但含硫類化合物種類較多。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總的揮發(fā)性成分種類整體上先增加后減少，在14 d時(shí)種類最多為71種，且相對含量最高為97.12%。酯類和烴類在發(fā)酵中也是先增后減的趨勢，酯類主要是微生物代謝產(chǎn)生的酶催化生成，在發(fā)酵6～12 d相對含量較高。烴類化合物在發(fā)酵第14天相對含量最高，達(dá)到60.95%。醇類在發(fā)酵過程中逐漸減少，而醛類與之相反，逐漸增加，酮類和酚類沒有明顯變化。酸類僅在發(fā)酵14 d的樣品中檢測到，有且僅有一種酸。含氮類化合物種類較少，且在一些樣品中未檢測到，在第14天的樣品中相對含量相對較高，為2.49%。含硫類化合物相對含量較高，在發(fā)酵第2天和第4天相對含量較低，分別為6.87%、5.62%，最高達(dá)到19.82%。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間的小米椒揮發(fā)性成分種類及相對含量Table 1 Types and relative contents of volatile components of shimatogarashi in different fermentation time

2.3 小米椒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香味物質(zhì)的變化

小米椒中各揮發(fā)性成分的相對含量見表2，對小米椒中相對含量大于1%的組分進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖2。

從表2和圖2可以看出，在小米椒發(fā)酵的16 d內(nèi)，最主要的揮發(fā)性成分都是烴類物質(zhì)，相對含量最高的是香樹烯，分別是7.18%、13.63%、15.17%、14.82%、12.28%、11.82%、8.50%、11.98%、17.56%，其次是二甲基十三烷、2-甲基-1-十四（碳）烯、2-甲基四癸烷。烷烴類物質(zhì)香氣較弱，一般不作為發(fā)酵辣椒的呈香物質(zhì)[9]，而烯烴類物質(zhì)一般閾值較低，且相對含量較高、種類豐富，是發(fā)酵辣椒中的主要呈香物質(zhì)，呈現(xiàn)豐富的木材、水果和香料的復(fù)合香[7]。在辣椒粉中，烯烴類物質(zhì)對其風(fēng)味也有較大貢獻(xiàn)。

酯類物質(zhì)是發(fā)酵小米椒中的第二大揮發(fā)性成分，其中2-甲基丁酸己酯相對含量較高，從發(fā)酵起始到終止其相對含量分別是4.82%、2.26%、1.11%、3.24%、3.52%、2.72%、6.26%、2.34%、2.81%。另外，相對含量＞1%的酯類還有柳酸甲酯、己酸己酯、反式-4-癸烯酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸芳樟酯。辣椒在成熟過程中，酯類物質(zhì)含量逐漸下降，在發(fā)酵過程中，酯類物質(zhì)主要是由有機(jī)酸和醇類物質(zhì)在酶的作用下酯化形成，提供強(qiáng)烈的果香，且閾值較低[13]，是辣椒制品的重要呈香物質(zhì)。

除烴類和酯類外，醇類是發(fā)酵小米椒的第三大類物質(zhì)，最主要的是乙醇和芳樟醇。乙醇在發(fā)酵過程中由于酵母菌的酒精發(fā)酵作用，相對含量逐漸增加，分別是0.24%、1.08%、1.64%、2.35%、2.13%、3.02%、3.96%、5.21%、5.34%，在發(fā)酵12 d到14 d，乙醇含量增幅顯著（P＜0.05），使小米椒具有特殊的酒香氣。與乙醇變化趨勢相反的有正己醇、正庚醇、蘑菇醇、反式-橙花叔醇、α-松油醇以及芳樟醇，其中以芳樟醇相對含量較高，在發(fā)酵過程中分別是4.40%、3.98%、2.19%、1.29%、2.26%、1.88%、2.17%、1.68%、0.21%，在辣椒汁的發(fā)酵過程中，芳樟醇的含量也是逐漸降低，賦予小米椒青香[14]。另外，正己醇具有果香和甜椒香，庚醇具有蘑菇香和脂肪香，苯甲醇具有花香和果香[15]，整體豐富了發(fā)酵小米椒的香氣。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間的小米椒揮發(fā)性成分相對含量Table 2 Relative contents of volatile components of shimatogarashi in different fermentation time

續(xù)表

續(xù)表

圖2 小米椒揮發(fā)性成分聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmap of volatile components of shimatogarashi

醛類和酮類物質(zhì)雖然在小米椒中相對含量較低，但兩種物質(zhì)閾值也較低[16]，對小米椒發(fā)酵后的整體風(fēng)味具有重要作用。醛類物質(zhì)在發(fā)酵過程中種類和相對含量都在逐漸增加，在發(fā)酵初期，只有（E）-2-庚烯醛和巴豆醛，兩者相對含量分別是0.79%和0.12%；在發(fā)酵14 d時(shí)，醛類物質(zhì)種類最多且總的相對含量最高，分別有2-己烯醛（0.15%）、（E）-2-庚烯醛（1.38%）、巴豆醛（0.35%）、反式-2-壬烯醛（0.33%）、反，反-2,4-庚二烯醛（0.28%）、正己醛（0.26%）、苯甲醛（0.26%）、反式-2-戊烯醛（0.26%）、十五醛（0.22%）、苯乙醛（0.12%）。醛類一般呈現(xiàn)青草香和脂肪香，氣味較好，但過量的醛會(huì)引起食品的酸敗和苦澀味[17]。在本研究中，發(fā)酵16 d時(shí)，醛類物質(zhì)有下降趨勢。酮類物質(zhì)相對含量在發(fā)酵過程中變化較小，但種類變化較大，僅有BETA-二氫紫羅蘭酮在發(fā)酵各個(gè)階段均存在。酸類物質(zhì)僅有乙酸在發(fā)酵14 d的樣品中檢測到，可能是因?yàn)樵谶@個(gè)發(fā)酵體系中植物乳桿菌和酵母菌的產(chǎn)酸能力較弱。有研究表明，在發(fā)酵的辣椒汁中檢測到13種酸類，包括乙酸、辛酸、壬酸等；在發(fā)酵鲊?yán)苯分袡z測到5種酸，但其中不含乙酸，說明不同品種辣椒發(fā)酵產(chǎn)酸情況不一樣[14，18]。

呋喃類物質(zhì)在小米椒發(fā)酵前期未能檢測到，在發(fā)酵第14天檢測到2-正戊基呋（0.79%）和2,3-二氫苯并呋喃（0.12%），閾值較低，具有黃油和八角的味道。含氮類物質(zhì)在也是在發(fā)酵14 d時(shí)含量相對含量最高，含有氨基甲酸銨（2.21%）和N-甲基吡咯（0.28%）兩種。除上述物質(zhì)之外，還有特殊香味的含硫類化合物，在大蒜和洋蔥中含硫類物質(zhì)含量較高[9]。在發(fā)酵過程中含硫類物質(zhì)最高相對含量達(dá)到19.82%，形成了發(fā)酵小米椒獨(dú)特的風(fēng)味，在發(fā)酵10 d后相對含量逐漸下降，其中以二烯丙基二硫?yàn)橹?，其相對含量分別是12.64%、5.23%、4.99%、12.87%、7.72%、16.76%、13.92%、10.67%、6.53%。二烯丙基二硫具有生物活性作用，能夠誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞分化、抑制其侵襲[19]。在發(fā)酵后期，小米椒中還含有烯丙基甲基二硫、二烯丙基硫醚等。

2.4 小米椒發(fā)酵過程中的風(fēng)味差異分析

在圖2中，熱圖橫軸是通過聚類分析得到的發(fā)酵過程中小米椒樣品的聚類情況[20]，可以看出剛開始發(fā)酵的小米椒的風(fēng)味與后面發(fā)酵過的差異較大，發(fā)酵2 d和4 d的較為相似，10 d和12 d的較為相似，較為奇怪的是發(fā)酵8 d與14 d以及16 d的風(fēng)味差異不大。

為了驗(yàn)證熱圖聚類結(jié)果，根據(jù)小米椒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性化合物，對小米椒進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果見圖3。PCA通過降維分析能夠考察多個(gè)變量間的相關(guān)性以及差異性，分析結(jié)果中第1主成分（PC1）的方差貢獻(xiàn)率為54.690%，第2主成分（PC2）的方差貢獻(xiàn)率為40.888%，總和＞95%，能夠很好地反映各樣品信息并體現(xiàn)出樣品之間的差異。從距離來看，同熱圖聚類一樣，起始階段的小米椒與其他樣品距離較遠(yuǎn)，差異較大；第2天和第4天、第12天和第10天、第6天和第8天、第14天和第16天分別距離較近，風(fēng)味化合物的組成及含量較為相似，說明小米椒在28 ℃恒溫發(fā)酵過程中，大約是以4 d為一個(gè)時(shí)間段風(fēng)味發(fā)生較大變化。

圖3 小米椒揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile components of shimatogarashi

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以新鮮小米椒為原料，在28 ℃恒溫條件下進(jìn)行發(fā)酵，利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵小米椒進(jìn)行分析，研究恒溫發(fā)酵小米椒的主要揮發(fā)性成分變化規(guī)律。結(jié)果表明，小米椒中揮發(fā)性成分包括酯、烴、醇、酮、醛、酚、酸、呋喃、含硫類以及含氮類化合物，其中以烴類為主，尤其是香樹烯、二甲基十三烷和2-甲基-1-十四（碳）烯。從發(fā)酵開始到結(jié)束，每隔2 d的小米椒中分別檢測到66、62、64、53、64、61、66、70、66種化合物，各類物質(zhì)在種類上都有不同程度的變化，但整體上趨于平均。在相對含量上，烴類、酯、醇、醛、酚以及呋喃的相對含量在發(fā)酵過程中都明顯增加，含硫類相對下降。在發(fā)酵14 d時(shí)，小米椒中風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對含量均相對較。綜合電子鼻PCA分析、GC-MS聚類分析以及感官分析，不同發(fā)酵時(shí)間的小米椒風(fēng)味物質(zhì)存在差異，發(fā)酵14d的小米椒香味濃郁、口感協(xié)調(diào)，風(fēng)味最佳。