朱勝男 ，曹嘉閩，葉 華，李松林，陳曉明*，季 方，張丹丹，袁小轉(zhuǎn)，胡佳佳，劉夢夏，張 旺，許光斗

（1.淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223001；2.江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇 淮安 223001）

水蜜桃（Prunus persica）又稱長壽果，其汁多味美，富含人體所需的多種營養(yǎng)素，營養(yǎng)價值高[1]。但水蜜桃易腐爛變質(zhì)，即使采用低溫保藏，也只能存放15 d左右，供應(yīng)期短[2]。因此許多桃園都采用土法將水蜜桃發(fā)酵成酒，以減少損失。土法釀制后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在酒體偏酸，口感生硬不柔和的缺陷。經(jīng)檢測土法釀制的水蜜桃酒中乙酸含量為1.415 g/L，而乙酸是揮發(fā)酸的主要成分，約占揮發(fā)酸的90%[3]。揮發(fā)酸是酒中的有害物質(zhì)，酸味極強，影響酒的品質(zhì)[4]。因此果酒中乙酸的含量直接影響揮發(fā)酸的含量。無病蟲害的水蜜桃中并不含乙酸，乙酸是在酵母發(fā)酵的過程中產(chǎn)生的。乙酸產(chǎn)生的主要原因是發(fā)酵液被醋酸菌所污染將乙醇轉(zhuǎn)化成了乙酸，或者是由于酵母的不正常發(fā)酵產(chǎn)生了不良代謝產(chǎn)物[5]。乙酸的含量越高，揮發(fā)酸含量就會越高，果酒的香氣越不明顯，酸澀味越強，協(xié)調(diào)性越差，生硬后苦感越強[6]。目前對桃酒的研究和報道多集中在釀造工藝[7]和澄清[8]等方面，少有對乙酸含量進行研究。

本研究擬對水蜜桃酒中乙酸進行研究和控制，基于單因素試驗，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件來抑制醋酸菌的生長或給予酵母優(yōu)良的發(fā)酵環(huán)境來降低乙酸含量，進而降低水蜜桃酒中揮發(fā)酸的含量。同時對水蜜桃酒的品質(zhì)指標進行檢測，為水蜜桃果酒進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蜜桃：江蘇陶然生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；果膠酶（≥132 000 AVJP/g）：荷蘭帝斯曼有限公司；白砂糖（食品級）：柳州市柳冰食品廠；乙酸（分析純）、甲醇、磷酸、磷酸二氫鉀（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9030A恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；JA5003N分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司；labostarTM TWF UV7純水儀：上海西門子水處理技術(shù)有限公司；1200安捷倫高效液相色譜儀：安捷倫科技（北京）有限公司；3K15高速冷凍離心機：德國Sigma實驗室離心機公司；PH計：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水蜜桃酒釀制工藝流程及操作要點

水蜜桃→分選清洗去核→切塊破碎→SO2護色→酶解→補糖→接種酵母菌→發(fā)酵→酒糟分離→后發(fā)酵→水蜜桃酒

操作要點：

水蜜桃預(yù)處理：選取成熟、個大飽滿的優(yōu)良水蜜桃，清洗干凈后切塊去核，使用榨汁機破碎果肉得到水蜜桃漿汁。

護色：在水蜜桃漿汁中加入140 mg/L的偏重亞硫酸鉀使SO2的添加量為70 mg/L。

酶解：加入2mL/100L的帝斯曼果膠酶于50℃酶解1.5 h，酶解pH為4，酶解后不進行滅酶處理。

補糖：水蜜桃漿汁的糖度為60～100 g/L，為了達到試驗所需的酒精度，需要將漿汁的糖度補充至200 g/L。本試驗采用兩種補糖方式：一次加糖和二次加糖。一次加糖為一次性將起始糖量補充至200 g/L；二次加糖為先將水蜜桃漿汁的糖度補充至160 g/L，待發(fā)酵3 d后再補充40 g/L至200 g/L。

發(fā)酵：用10%的溫糖水對活性干酵母進行活化并按照總質(zhì)量的0.2%接種，置于21 ℃無氧發(fā)酵15 d，待發(fā)酵液中的含糖量低于10 g/L時結(jié)束發(fā)酵。

酒糟分離：待發(fā)酵結(jié)束后，用無菌濾布將水蜜桃酒濾出。

后發(fā)酵：為了使水蜜桃酒風味成熟，促進酒體的澄清，將濾出的水蜜桃酒于15 ℃后發(fā)酵90 d，得水蜜桃酒。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以乙酸含量為評價指標，分別考察不同起始糖量（160g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L、240 g/L）、不同加糖方式（一次加糖、二次加糖）、SO2的添加量（0、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、90 mg/L）以及發(fā)酵溫度（15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃）對乙酸含量的影響。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

通過單因素試驗，選擇3個主要影響因素起始糖量（A）、SO2添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）為影響因素，以乙酸含量（Y）作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken進行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，試驗水平分別用-1、0、1來表示，試驗設(shè)計水平編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵工藝因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for optimization of fermentation technology

1.3.4 乙酸含量的檢測

乙酸含量檢測采用高效液相色譜法。

標準溶液的配制：分別配制0.312 5 g/L、0.625 0g/L、1.250 0 g/L、2.500 0 g/L、5.000 0 g/L的五個質(zhì)量濃度梯度的乙酸標準溶液[9]。

樣品預(yù)處理：將水蜜桃的發(fā)酵液離心后，取上清液過0.25 μm微孔濾膜[10]。

色譜條件：Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進樣量10 μL；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；波長210 nm；流動相A甲醇；流動相B水相；流動相C磷酸緩沖液；采集時間40 min[11]。

定性定量分析：將乙酸單標和不同梯度的乙酸標品進樣，確定出峰時間，制作乙酸標準曲線。將水蜜桃酒樣品進樣，通過出峰時間進行乙酸定性，按照乙酸標準曲線回歸方程計算乙酸含量。

1.3.5 水蜜桃酒品質(zhì)指標的檢測

總糖、總酸、酒精度的測定參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；pH的測定：使用pH計；異丁醇、異戊醇、雜醇油：氣相色譜法[12]；甲醇：參照GB 5009.266—2016《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》；黃酮：蘆丁當量法[13]；總酚：福林-酚法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸標準曲線的繪制

圖1 乙酸標準品高效液相色譜圖Fig.1 Chromatography of acetic acid standard analysis by HPLC

圖2 乙酸標準曲線Fig.2 Standard curve of acetic acid

乙酸含量進行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖1。以乙酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制乙酸標準曲線，結(jié)果見圖2。

由圖1可知，乙酸標準品的出峰時間為8.470 min，由圖2可知，乙酸標準曲線回歸方程為y=368.067x-4.8125，線性范圍為0.312 5～5.000 0 g/L，相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0，檢出限為0.001 2 g/L。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 起始糖量的確定

圖3 不同起始糖量對乙酸含量的影響Fig.3 Effect of different initial sugar contents on acetic acid contents

由圖3可知，不同的起始糖量會導(dǎo)致乙酸含量的不同，隨著起始糖量的降低乙酸也會隨之降低，起始糖量為160 g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L、240 g/L時，發(fā)酵15 d時的乙酸含量分別為0.524 g/L、0.528 g/L、0.537 g/L、0.612 g/L、0.691 g/L。采用較低的起始糖量乙酸含量會明顯降低，這是因為較高的起始糖量導(dǎo)致酵母所處環(huán)境的滲透壓高[15]，會抑制酵母生長，從而不能進行正常的酒精發(fā)酵，導(dǎo)致乙酸較高，這與蔡錦林[16]研究的結(jié)果一致。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)降低起始糖量可以有效降低乙酸的含量，采用160 g/L、180 g/L、200 g/L的起始糖量產(chǎn)生的乙酸較為接近，同時考慮試驗需達到的酒精度，選用最適起始糖量為200 g/L。

2.2.2 加糖方式的確定

圖4 不同加糖方式對乙酸含量的影響Fig.4 Effect of different adding sugar methods on acetic acid contents

由圖4可知，二次加糖方式相比于一次加糖能夠有效控制乙酸的含量，乙酸隨發(fā)酵時間延長而上升的趨勢較平緩，乙酸含量從0.537 g/L降至0.501 g/L，比一次加糖下降了6.704%，這是因為一次加糖較二次加糖在同一時間段內(nèi)產(chǎn)生的滲透壓高，所以二次加糖更利于酵母進行酒精發(fā)酵，減少不良發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生。因此，選用二次加糖方式。

2.2.3 SO2添加量的確定

SO2是發(fā)酵中常用的食品添加劑，其作用主要有抑菌、抗氧化、降低褐變程度、增酸、改善果酒風味等[17]。過量或不足都會影響酒的口感和品質(zhì)，對乙酸也會產(chǎn)生一定影響。由圖5可知，當SO2添加量為0、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、90mg/L時，發(fā)酵15d時的乙酸含量分別為0.924g/L、0.741g/L、0.659 g/L、0.537 g/L、0.575 g/L。在一定范圍內(nèi)乙酸含量隨SO2添加量的增加在逐漸降低，相比于不添加SO2的水蜜桃酒乙酸得到明顯抑制，SO2的添加可以抑制雜菌的生長，因此能有效控制乙酸的含量。但SO2也會增加果酒的酸度，同時過高的SO2含量不利于酵母的正常發(fā)酵，SO2的添加量過大時，乙酸的含量也會增加，從而當SO2為90 mg/L時，乙酸的含量較70 mg/L時有所上升，這與周濃[18]的研究結(jié)果一致。因此，選用最適SO2添加量為70 mg/L。

圖5 不同SO2添加量對乙酸含量的影響Fig.5 Effect of different SO2 addition on acetic acid contents

2.2.4 發(fā)酵溫度的確定

酵母菌體內(nèi)的酶活受發(fā)酵溫度的影響，發(fā)酵溫度不適會導(dǎo)致不正常的酒精發(fā)酵，產(chǎn)生乙酸[19]。由圖6可知，發(fā)酵溫度為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃時，發(fā)酵15天時的乙酸含量為0.623 g/L、0.583 g/L、0.537 g/L、0.652 g/L、0.764 g/L，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的降低乙酸的含量也會降低，這是由于低溫會抑制醋酸菌的生長，減少乙酸的產(chǎn)生，因此當發(fā)酵溫度從27 ℃降至21 ℃時，乙酸含量從0.764 g/L降至0.537 g/L。當發(fā)酵溫度繼續(xù)降低至15 ℃時，乙酸含量有所增加，這是因為溫度過低時，酵母的生長也會受到抑制，發(fā)酵遲緩，起酵速度慢，產(chǎn)生不良的代謝產(chǎn)物。因此在一定溫度范圍內(nèi)，采用低溫發(fā)酵能抑制其他雜菌的酶活，進而抑制其生長，能有效控制乙酸，這與張晶[20]的研究結(jié)果一致。因此，選用最適發(fā)酵溫度為21 ℃。

圖6 不同發(fā)酵溫度對乙酸含量的影響Fig.6 Effect of different fermentation temperature on acetic acid contents

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇3個主要影響因素起始糖量（A）、SO2添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）為影響因素，以乙酸含量（Y）作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行設(shè)計，并按照設(shè)計進行響應(yīng)面試驗，每組試驗設(shè)置3個平行，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization

對表2的數(shù)據(jù)進行分析，得到擬合方程為：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，模型中F值=181.97，P＜0.000 1，說明模型差異極顯著（P＜0.01）；失擬項P值=0.347 5＞0.05，說明失擬項不顯著，說明模型可用于預(yù)測。模型決定系數(shù)R2=0.9957，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.9903，預(yù)測決定系數(shù)R2pred=0.9610，都＞0.9，并且R2adj與R2pred值相近，表明實驗值與預(yù)測值相近，相關(guān)性好，可以用來預(yù)測水蜜桃酒控制乙酸的工藝優(yōu)化。

F值表示對乙酸的影響力大小，F(xiàn)值越大說明對乙酸的影響越大。從表3中得出FA=371.08，F(xiàn)B=29.33，F(xiàn)C=70.42，因此A、B、C3個因素的對乙酸的影響順序為A＞C＞B，即起始糖量＞發(fā)酵溫度＞SO2添加量，且A、B、C三個因素的都對乙酸的影響極顯著（P＜0.01）。

3個因素的交互響應(yīng)面及等高線如圖7所示，AB、AC、BC交互影響等高線為圓形，表明交互影響不顯著，而A2、B2、C2對乙酸的影響極顯著（P＜0.01）。

根據(jù)響應(yīng)面試驗得到發(fā)酵過程中控制乙酸的最佳發(fā)酵工藝為起始糖量179.80 g/L，SO2添加量72.12 mg/L，發(fā)酵溫度20.53 ℃，在此條件下乙酸含量預(yù)測值為0.498 g/L。為了便于實際操作，將最佳發(fā)酵工藝修正為起始糖量180 g/L，SO2添加量72 mg/L，發(fā)酵溫度21 ℃。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，乙酸含量實際值為0.499 g/L，與預(yù)測值相近，證明模型有意義，采用最佳工藝能有效降低乙酸含量。

圖7 起始糖量、SO2添加量、發(fā)酵溫度交互作用對乙酸含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar contents,SO2 addition and fermentation temperature on acetic acid contents

2.4 水蜜桃酒品質(zhì)指標的檢測

由表4可知，水蜜桃酒的各項指標均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求，且乙酸、雜醇油含量較低，黃酮、總酚含量分別為84.053 mg/L、87.302 mg/L，品質(zhì)較高。該水蜜桃酒果香馥郁、醇香濃厚，酒體協(xié)調(diào)。

表4 水蜜桃酒品質(zhì)指標檢測結(jié)果Table 4 Detection results of quality indexes of peach wine

3 結(jié)論

本試驗針對水蜜桃酒酒體酸澀的問題，通過響應(yīng)面的方法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，有效降低了水蜜桃酒中乙酸的含量，得到了控制乙酸的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：起始糖量180 g/L，SO2添加量72 mg/L，發(fā)酵溫度21 ℃。在此優(yōu)化工藝條件下，乙酸含量為0.499 g/L，與土法釀制的水蜜桃酒相比，乙酸含量降低了64.73%，為今后水蜜桃酒中乙酸的控制與研究提供了理論依據(jù)。