楊 旭 ，馬歌麗，王光路，胡曉龍，張治剛，王永亮，劉智勇，李寶珍

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州市代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；3.賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，河南 漯河 462400；4.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 科技處，河南 鄭州 450001）

近20年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不同香型白酒大曲中的微生物（主要是細(xì)菌和真菌）種群結(jié)構(gòu)及其組成得到有效解析，如所有香型白酒大曲中均鑒定出乳桿菌屬（Lactobacillus）；濃香和醬香型白酒大曲中優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌屬（Bacillus）[1-2]；扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）在清香和濃香型白酒大曲中被檢測到；醬香型白酒大曲中特殊微生物為疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanugino sus）[3]。由于白酒釀造主要原料高粱中含有的淀粉不能被大多數(shù)酵母菌和細(xì)菌直接利用，需要通過絲狀真菌產(chǎn)生的α-淀粉酶和糖化酶水解為可發(fā)酵糖[4]，所以真菌在大曲釀造過程中發(fā)揮重要作用。如成熟茅臺風(fēng)味大曲中檢測出多種真菌：曲霉屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）和根霉屬（Rhizopus），總狀毛霉（Mucor racemosus）和嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）[5-6]。微生物區(qū)系對成品大曲香氣的優(yōu)劣有著直接的影響[7]。然而，目前微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究大部分集中在濃香、醬香和清香型等主流白酒釀造過程，關(guān)于北方不同香型白酒大曲中微生物相關(guān)的研究還較少。

高通量測序技術(shù)已被廣泛用于分析發(fā)酵食品（如白酒、葡萄酒、醋和醬油等）微生物群落的組成[8-10]?；谠摷夹g(shù)，本實(shí)驗(yàn)研究了賈湖白酒大曲發(fā)酵過程中理化性質(zhì)和微生物（細(xì)菌和真菌）結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化；確定大曲樣品中細(xì)菌和真菌類群的相對豐度和多樣性，對鑒定和判斷大曲制曲過程相關(guān)的主要微生物、指導(dǎo)大曲生產(chǎn)，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品：河南漯河賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司曲房制作過程中的樣品曲，取樣點(diǎn)為入房（JH1）、第1次翻曲（JH2）、第2次翻曲（JH3）、第3次翻曲（JH4）、出房（JH5）5個點(diǎn)。每次取樣固定為同一點(diǎn)，每次取樣3個曲塊，將樣品粉碎混合為一個區(qū)域的綜合樣（實(shí)驗(yàn)樣品），共獲取5個綜合實(shí)驗(yàn)樣品。實(shí)驗(yàn)樣品迅速置于-20 ℃保藏備用。

E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNA試劑盒：美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司；2×TaqMaster Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；MagicPureSizeSelection DNA Beads：北京全式金生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus X1R臺式離心機(jī)：Thermo Fisher公司；BE-1200漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6E型電泳儀電源，DYCP-31C型電泳槽：北京市六一儀器廠；Biodoc-IT凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；Qubit3.0熒光計(jì)：Invitrogen公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司；Research plus 單道可調(diào)量程移液器：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲水分和酸度測定

按照QB/T 4257—2011釀酒大曲通用分析方法測定大曲水分和酸度。

1.3.2 脫氧核糖核酸提取

稱取200 mg樣品，放入滅菌2 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，振蕩混勻，室溫條件下10 000 r/min離心3 min，棄置上層液體。加入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），振蕩混勻，室溫條件下10 000 r/min離心3 min，棄置上層液體。倒置2 mL管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA試劑盒的使用說明書[11]。

1.3.3 16S 核糖體核糖核酸和真菌種屬基因測序及序列分析

16S核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因PCR擴(kuò)增所用的引物為已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物：

341F 引 物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG

805R 引 物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，25次循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，10 ℃保持至停止。

真菌種屬（internal transcribed spacer，ITS）PCR擴(kuò)增所用的引物為已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的ITS1-2通用引物：

ITS1F 引 物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

ITS2R引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GCTGCGTTCTTCATCGATGC

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，25次循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，10 ℃保持至停止。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖（2%）電泳檢測?；厥盏腄NA利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒精確定量，按照1∶1等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度為20 pmol。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列[12]，序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先去除引物接頭序列，再根據(jù)雙末端（paired-end，PE）reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本的有效數(shù)據(jù)。采用軟件Usearch將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[13]。通常在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。將獲得的每個OTU的代表序列與在線數(shù)據(jù)庫（ribosomal database project，RDP）[14]進(jìn)行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾，默認(rèn)滿足相似度＞90%且Coverage＞90%的序列被用來后續(xù)分類[15]，確定每個OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬、種水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣品水分和酸度變化

大曲在制備過程中，由于溫度的變化，大曲水分含量逐漸降低，根據(jù)大曲質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定，大曲中的水分含量不能超過13%[16]。由圖1A可知，出房大曲（JH5）水分含量為8.38%（取樣時間為夏季，水分揮發(fā)較快）。大曲生產(chǎn)過程中由于水分低的關(guān)系生酸量低，常規(guī)酸度不會超過1.0。酸度主要是由產(chǎn)酸微生物在大曲中進(jìn)行有機(jī)酸代謝而形成，酸度大小可揭示大曲中產(chǎn)酸微生物的數(shù)量多寡，同時也歸因于大曲中脂肪酶和蛋白酶活力強(qiáng)弱[17]。由圖1B可知，大曲在入房時由于代謝旺盛，產(chǎn)酸最高，大曲JH1中酸度達(dá)到0.22 mmol/g。酸度的大小和微生物數(shù)量變化有很密切的關(guān)系，研究表明酸度大小與芽孢桿菌數(shù)量有正相關(guān)性[18]。本研究結(jié)果也證實(shí)該結(jié)論。在發(fā)酵期間，不同時間點(diǎn)大曲樣品芽孢桿菌屬相對豐度分別為2.90%、0.23%、0.10%、0.12%和0.18%，酸度也隨之降低和升高。所以，大曲生產(chǎn)過程中嚴(yán)格控制酸度有助于調(diào)控和平衡大曲中的微生物組成與數(shù)量，同時產(chǎn)生的有機(jī)酸還將與醇類化合物反應(yīng)產(chǎn)生濃郁的白酒風(fēng)味化合物[19-21]。

圖2 大曲生產(chǎn)過程中水分（A）和酸度（B）變化Fig.2 Changes in water content and acidity during Daqu fermentation

2.2 大曲微生物OTU多樣性

本研究劃分細(xì)菌和真菌OTU 分類信息樣本文庫覆蓋率（Coverage指數(shù)）都超過0.97，說明本次測序結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況，完全能夠反映該區(qū)域細(xì)菌和真菌群落的種類和結(jié)構(gòu)。由圖2可知，從大曲樣品入房到出房，細(xì)菌和真菌微生物多樣性指數(shù)（OUT值）表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并且都在曲溫達(dá)到頂溫時（大曲JH3）達(dá)到最高值。這也印證了整個培曲過程遵循“前緩、中挺、后緩落”的發(fā)酵規(guī)律[22]，即大曲的培菌、生香轉(zhuǎn)化主要在40 ℃～60 ℃～40 ℃這一溫度變化區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，因而大曲中富集很多耐高溫微生物，而后續(xù)的真菌和細(xì)菌群落的詳細(xì)分析數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了該結(jié)論。

圖2 DNA測序法測定大曲操作分類單元數(shù)目Fig.2 Number of operational taxonomic units in Daqu determined by DNA sequencing

2.3 大曲真菌群落ITS2 rRNA基因序列分析

由圖3A可知，所有大曲樣品中的真菌種群共5個門：子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和梳霉門（Kickxellomycota），其中子囊菌門在大曲JH1占主導(dǎo)地位（相對豐度74.03%）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，子囊菌門相對豐度逐漸減少，大曲JH3中減少到最低為26.94%，之后，又逐漸上升至大曲JH5中的47.38%。與之對應(yīng)的是毛霉亞門的此消彼長，由大曲JH1中的13.14%上升至大曲JH3中的71.47%，逐漸降低至大曲JH5中的36.28%。這可能是由于發(fā)酵過程中翻曲操作引起曲塊溫度的變化導(dǎo)致真菌結(jié)構(gòu)的演替：溫度升高有利于毛霉亞門類生長，而對子囊菌門類生長和繁殖有阻礙作用。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫階段（大曲JH3）時，毛霉亞門類相對豐度達(dá)到最高，擔(dān)子菌門類相對豐度降至最低為0.14%，被孢霉門和梳霉門類已檢測不到，說明絕大多數(shù)微生物停止生長。

由圖3B可知，入房大曲JH1中假絲酵母屬（Candida），酵母屬（Saccharomycetales），根霉屬（Rhizopus）和曲霉屬（Aspergillus）是優(yōu)勢菌屬，其相對豐度占全部真菌群落的74.46%以上，其中最優(yōu)勢菌屬是假絲酵母屬，約占35.69%，假絲酵母屬是大曲發(fā)酵過程重要的真菌之一，主要產(chǎn)酒精和酯類物質(zhì)[23]，而且大量產(chǎn)生酮類、烯類、酚類等揮發(fā)性化合物[24]，對大曲品質(zhì)有著決定性的影響。由于入房時溫度較低，霉菌和酵母菌均大量生長，給大曲的多種功能打下基礎(chǔ)。隨著溫度升高，霉菌生長越來越旺盛，其中毛霉屬（Rhizomucor）在大曲JH2、JH3中的相對豐度分別達(dá)到21.17%、29.63%，相比較于大曲JH1，同比增加了21.13%、29.59%。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時，橫梗霉屬（Lichtheimiaceae）成為優(yōu)勢菌群，相對豐度達(dá)到40.60%。在出房大曲JH5中，毛霉屬重新占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度達(dá)到34.44%，其次是根霉屬和曲霉屬。霉菌被視為大曲糖化降解動力的主要來源，為曲酒的釀造提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力及多種有機(jī)酸等物質(zhì)[25-26]。

圖3 大曲樣品中真菌在門（A）和屬（B）分級水平上的種類和相對豐度Fig.3 Types and relative abundance of fungi in Daqu samples at phylum level (A) and genus level (B)

2.3 大曲細(xì)菌群落16S rRNA基因序列分析

由圖4A可知，所有大曲樣品中的細(xì)菌種群共37個門，其中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）在大曲JH1占主導(dǎo)地位，其相對豐度占全部細(xì)菌群落的97.29%以上。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，厚壁菌門相對豐度逐漸增加，在大曲JH3中達(dá)到最高為87.27%，之后，又逐漸降低至大曲JH5中的67.97%。與之對應(yīng)的是變形菌門的此消彼長，由大曲JH1中的18.87%降低至大曲JH3中的1.86%，逐漸增加至大曲JH5中的18.87%。這可能是由于發(fā)酵過程中翻曲操作引起曲塊溫度的變化導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)的演替：溫度升高有利于厚壁菌門類生長，而對變形菌門類生長和繁殖有阻礙作用。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫階段（大曲JH3）時，厚壁菌門類相對豐度達(dá)到最高，變形菌門類相對豐度降至最低。

由圖4B可知，入房大曲JH1中分別檢測到乳桿菌屬（Lactobacillus），魏斯氏菌屬（Weissella），葡萄球菌屬（Staphylococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）、泛菌屬（Pantoea）和芽孢桿菌屬（Bacillus），其中最優(yōu)勢菌是乳桿菌屬，約占20.10%，乳桿菌屬是白酒生產(chǎn)中非常重要的微生物之一，在釀造過程中具有促進(jìn)美拉德反應(yīng)、促進(jìn)釀酒的發(fā)酵、維護(hù)與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[27]。魏斯氏菌屬屬于乳酸細(xì)菌，分解葡萄糖產(chǎn)生CO2異型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，有利于乳酸乙酯的形成及酒質(zhì)的穩(wěn)定，是白酒釀造中的重要微生物之一[28]。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時，高溫放線菌科克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）成為明顯優(yōu)勢菌群，相對豐度達(dá)到60.67%，乳桿菌屬降至最低為15.41%。高溫放線菌科克羅彭斯特菌的發(fā)現(xiàn)應(yīng)該屬于賈湖白酒大曲特殊微生物，結(jié)果說明高溫放線菌不單只存在于高溫大曲中，在中低溫大曲中同樣存在。該菌在醬香、濃香等主流香型白酒大曲中都未見報(bào)道，只在清香和芝麻香型白酒高溫大曲中被檢測出來[29-30]，還可能是因?yàn)榭瓶肆_彭斯特菌在大曲發(fā)酵過程中生存時間較短，不易于取樣檢測。隨著溫度降低，在出房大曲JH5中，科克羅彭斯特菌屬豐度已經(jīng)降低至0.28%，而乳桿菌屬重新占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度達(dá)到31.89%。

圖4 大曲樣品中細(xì)菌在門（A）和屬（B）分級水平上的種類和相對豐度Fig.4 Types and relative abundance of bacteria in Daqu samples at phylum level (A) and genus level (B)

3 結(jié)論

本研究分析了賈湖白酒大曲在整個發(fā)酵過程中的理化性質(zhì)以及真菌和細(xì)菌的組成。研究結(jié)果得到一個大曲數(shù)據(jù)庫，包含了5個不同發(fā)酵階段獲得的5個樣品的測序數(shù)據(jù)。大曲樣品從入房到出房，細(xì)菌和真菌微生物多樣性指數(shù)（OTU值）表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并且都在曲溫達(dá)到頂溫時（大曲JH3）達(dá)到最高值。這也印證了整個培曲過程遵循“前緩、中挺、后緩落”的發(fā)酵規(guī)律，即大曲的培菌、生香轉(zhuǎn)化主要在40 ℃～60 ℃～40 ℃這一溫度變化區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。賈湖白酒大曲生產(chǎn)過程中發(fā)酵前期真菌主要有假絲酵母屬（Candida）、根霉屬（Rhizopus）和曲霉屬（Aspergillus），當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時，橫梗霉屬（Lichtheimiaceae）成為優(yōu)勢菌群，發(fā)酵后期以毛霉屬（Rhizomucor）和曲霉屬為主。賈湖白酒大曲入房和出房樣品中細(xì)菌組成變化不大，乳桿菌屬（Lactobacillus）在整個發(fā)酵過程中一直存在。在發(fā)酵期間，不同時間點(diǎn)大曲樣品芽孢桿菌屬相對豐度分別為2.90%，0.23%、0.10%、0.12%和0.18%，酸度也隨之降低和升高，表明大曲酸度大小與芽孢桿菌數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)性。當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時，高溫放線菌科克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）成為優(yōu)勢菌群，相對豐度達(dá)到60.67%，該菌屬微生物應(yīng)該屬于賈湖白酒大曲中特殊微生物之一。細(xì)菌和真菌成分的這種動態(tài)變化是由大曲生產(chǎn)工藝過程翻曲操作和溫度變化引起的。由于整個發(fā)酵過程中未接種發(fā)酵劑，這種相對穩(wěn)定的細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)還可能與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)。