劉笑笑，金永梅，吳 迪，王 瑩，魏春雁

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)春），吉林 長(zhǎng)春 130033）

泡菜是一類有著悠久歷史的傳統(tǒng)食品，按產(chǎn)地及口味主要分為中國(guó)泡菜、韓國(guó)泡菜和日本泡菜，日本泡菜屬于非發(fā)酵型，中國(guó)泡菜和韓國(guó)泡菜屬于發(fā)酵型[1]。朝鮮族泡菜是極具民族特色的中國(guó)泡菜之一，種類繁多，各具獨(dú)特的風(fēng)味且富含乳酸菌和乳酸[2]。櫻菜是朝鮮族人種植的特色蔬菜，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道適合大眾口味，但生長(zhǎng)期短且具有季節(jié)性，因此，將其制成朝鮮族泡菜，提高了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和貯藏性[3]。

朝鮮族泡菜是一種風(fēng)味獨(dú)特的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，富含活性乳酸菌，可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。部分學(xué)者已對(duì)朝鮮族泡菜中的微生物進(jìn)行了研究，孟令帥等[4]從25份朝鮮族家庭制作的傳統(tǒng)發(fā)酵辣白菜中分離出81株乳酸菌，其中34株桿菌、47株球菌，歸屬于2個(gè)屬6個(gè)種，45株屎腸球菌（Enterococcus faecium）、25 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、4株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、3株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、2株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、2株堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcus durans）；劉長(zhǎng)蕾等[5]對(duì)朝鮮族辣白菜發(fā)酵過(guò)程中微生物變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，明串珠菌（Leuconostoc）是發(fā)酵蔬菜食品發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)酵至8 d時(shí)明串珠菌數(shù)量達(dá)到最高，發(fā)酵20 d后，檢測(cè)不到明串珠菌。目前對(duì)朝鮮族泡菜的研究集中于朝鮮族辣白菜，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜的研究報(bào)道甚少。此外，朝鮮族泡菜制作簡(jiǎn)便、成本低廉、食用方便，但發(fā)酵過(guò)程中存在著食用安全的問(wèn)題，最值得關(guān)注的就是亞硝酸鹽，因此，分離降解亞硝酸鹽的菌株很有必要。

腸膜明串珠菌是乳酸菌中明串珠菌屬（Leuconostocsp.）的重要菌種[6-8]，是自然發(fā)酵食品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[9]。對(duì)人和動(dòng)物均無(wú)毒性和致病作用，尤其是腸膜明串珠菌腸膜亞種已被我國(guó)衛(wèi)生部（2012年第8號(hào)公告）與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）列為可食用菌種之一[10]。腸膜明串珠菌具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，改善產(chǎn)品風(fēng)味，同時(shí)具有抗氧化能力和拮抗致病菌能力[11-12]。因其能夠產(chǎn)生特殊風(fēng)味物質(zhì)，在乳和泡菜等食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3，13-14]。

本研究從具有民族特色的延邊朝鮮族地區(qū)采集24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜，從中分離篩選具有降解亞硝酸鹽功能的腸膜明串珠菌，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA基因序列分析進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸特性、耐鹽特性和耐酸堿特性進(jìn)行研究。旨在為進(jìn)一步研究其生理功能和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜分別取自延邊朝鮮族自治州金剛山泡菜專賣店、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市，取樣時(shí)間為2017年4月9日。

1.1.2 主要試劑

亞硝酸鈉（分析純）：昆山東南化工材料有限公司；氯化鈉（分析純）：東莞市聚鵬化學(xué)有限公司；1%萬(wàn)古霉素（分析純）：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；扁桃苷、熊果糖、水楊苷、赤蘚醇（均為優(yōu)級(jí)純）：上海麥克林生化科技有限公司；甘露糖（優(yōu)級(jí)純）：德國(guó)MERCK公司；L-鼠李糖（分析純）：上?；瘜W(xué)試劑總廠試劑二廠；半乳糖、山梨醇、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-木糖、棉子糖、L-山梨糖、蜜二糖（均為優(yōu)級(jí)純）：美國(guó)Sigma公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

最低必需培養(yǎng)基（lowest minimal medium，LMM）、MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PRESOCLAVE-Ⅱ高壓滅菌器：西班牙SELECTA公司；2720 thermal cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Applied Biosystems公司；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CX41-RF熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 腸膜明串珠菌的分離與純化

無(wú)菌條件下，取延邊朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜汁1 mL涂布于LMM固體培養(yǎng)基，28 ℃倒置恒溫有氧培養(yǎng)48～72 h。挑取周圍產(chǎn)生水滴狀粘稠性多糖的菌落，在含有30 μg/mL萬(wàn)古霉素的MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次。挑取單菌落，經(jīng)鏡檢，確認(rèn)獲得單一菌種。

1.3.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

以不加亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，取分離的菌株，以3%（V/V）的接種量分別接種于含質(zhì)量濃度為150 μg/mL亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，采用鹽酸萘乙二胺法[15]測(cè)定菌液中亞硝酸鹽含量，并計(jì)算亞硝酸鹽降解率，其計(jì)算公式如下：

式中：X為亞硝酸鹽降解率，%；Y為亞硝酸鈉初始含量，mg/kg；Y1為發(fā)酵后亞硝酸鈉含量，mg/kg。

選篩亞硝酸鹽降解率＞50%以上的菌株。

1.3.3 降解亞硝酸鹽菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)[16-18]

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[18]的方法對(duì)篩選菌株進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化鑒定。生理生化試驗(yàn)項(xiàng)目包括37 ℃生長(zhǎng)試驗(yàn)、1 ℃生長(zhǎng)試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、葡聚糖生成試驗(yàn)、檸檬酸利用試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)和碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)。

（2）分子生物學(xué)鑒定

采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，選用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19-20]，正向引物為7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；反向引物為1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL、TakaraTaq酶0.2 μL、引物7F0.5μL、引物1540R0.5μL、加雙蒸水（ddH2O）至25μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，選取堿基長(zhǎng)度為1 500 bp處亮度和長(zhǎng)度適宜的條帶，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基本局部比對(duì)工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）檢索，選取序列同源性最高的已知菌種的16S rRNA序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21]。

1.3.4 降解亞硝酸鹽菌株生長(zhǎng)特性研究

最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定：取活化的篩選菌株，以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于25 ℃、28 ℃、30 ℃和36 ℃培養(yǎng)48 h，采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定其吸光度值（OD600nm值）。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：以不接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。將活化好的篩選菌株以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，采用分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

產(chǎn)酸能力的測(cè)定：以不接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。將活化好的篩選菌株，以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定其pH值。

耐鹽性能的測(cè)定：取活化的篩選菌株，以2%（V/V）的接種量分別接種于含0、4%、6%、8%和10% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，采用分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

耐酸堿性能的測(cè)定：以不接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將活化好的篩選菌株以2%（V/V）的接種量分別接種于初始pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，采用分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 17.0和Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸膜明串珠菌的分離與純化

通過(guò)LMM培養(yǎng)基分離，從24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜中共分離出20株帶有水滴狀粘稠性多糖的菌落；其中17株能在含30 μg/mL萬(wàn)古霉素的MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

2.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

測(cè)定分離得到的17株菌株的亞硝酸鹽降解能力，亞硝酸鹽降解率見(jiàn)圖1。

圖1 17株菌株的亞硝酸鹽降解能力Fig.1 Nitrite degradation capacity of 17 strains

由圖1可知，菌株JNZB003、JNZB005、JNZB009 和JNZB015的亞硝酸鹽降解率均＞50%，分別為95.92%、88.36%、52.71%、61.62%。

2.3 降解亞硝酸鹽菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

4株具有降解亞硝酸功能的菌株中，菌株JNZB003在LMM培養(yǎng)基和含30 μg/mL萬(wàn)古霉素的MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見(jiàn)圖2，4株菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖3。

圖2 菌株JNZB003在LMM培養(yǎng)基（a）和含30 μg/mL萬(wàn)古霉素MRS固體培養(yǎng)基（b）上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain JNZB003 on LMM medium (a) and MRS solid medium with vancomycin 30 μg/ml (b)

圖3 篩選菌株的革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Gram staining results of screened strains

由圖2可知，菌株JNZB003在LMM培養(yǎng)基上呈水滴狀菌落，在30 μg/mL萬(wàn)古霉素MRS培養(yǎng)基上，菌落呈圓形、乳白色、表面光滑，其他菌株菌落形態(tài)相似。由圖3可知，4株菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞形態(tài)呈球形和短桿形，成對(duì)或成短鏈排列。

2.3.2 生理生化試驗(yàn)

將4株具有降解亞硝酸鹽功能的菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1～表2。

表1 篩選菌株生理特性鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of physiological characteristics of screened strains

由表1可知，4株菌株均對(duì)30 μg/mL萬(wàn)古霉素具有耐受性，過(guò)氧化氫酶陰性，1 ℃條件下均不生長(zhǎng)，37 ℃條件下均生長(zhǎng)；在3%和6.5%氯化鈉溶液中不同程度生長(zhǎng)，其中菌株JNZB003、JNZB009和JNZB015在3%和6.5%氯化鈉溶液中生長(zhǎng)良好，菌株JNZB005在3%氯化鈉生長(zhǎng)良好，但在6.5%氯化鈉溶液中微弱生長(zhǎng)。

表2 篩選菌株生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of biochemical characteristics of screened strains

由表2可知，4株菌株精氨酸水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性反應(yīng)；菌株JNZB003和JNZB009能夠代謝檸檬酸，而菌株JNZB005和JNZB015不能代謝檸檬酸；菌株JNZB003和JNZB015能水解七葉苷，而菌株JNZB005和JNZB009不能水解七葉苷；菌株JNZB003、JNZB005和JNZB009能生成葡聚糖，而菌株JNZB015不能生成葡聚糖。

表3 篩選菌株的碳源利用試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of carbon source utilizing tests of screened strains

由表3可知，4株菌株都可以利用纖維二糖、蜜二糖、蔗糖、果糖、熊果糖、海藻糖、甘露糖、水楊苷、扁桃苷；都不能利用赤蘚醇、山梨醇、L-山梨糖和L-鼠李糖；此外，菌株JNZB003可以利用半乳糖、麥芽糖、D-木糖、棉子糖、L-阿拉伯糖和核糖；菌株JNZB005可以利用D-木糖和L-阿拉伯糖；菌株JNZB009可以利用半乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖和D-木糖。

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中對(duì)明串珠菌屬的描述，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性試驗(yàn)，初步判斷4株菌株均為明串珠菌屬（Leuconostocsp.）。

2.3.3 菌株的16S rRNA基因序列分析

在形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)篩選的4株菌株進(jìn)行16S rRNA序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。以提取的4株菌株基因組為模板，利用16S rRNA通用引物，分別擴(kuò)增出1.5 kb的目的片段。通過(guò)PCR產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序，獲得4株菌株的近乎全長(zhǎng)16S rRNA 基因片段。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢索，選取序列同源性最高的已知菌種的16S rRNA序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 基于16S rRNA基因序列4株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 4 strains based on 16S rDNA gene sequences

由圖4可知，4株菌株均屬于明串珠菌屬（Leuconostocsp.）。其中菌株JNZB003與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）親緣關(guān)系最近；菌株JNZB005和JNZB009與冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）親緣關(guān)系最近；菌株JNZB015與肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）親緣關(guān)系最近。

綜上，綜合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，將菌株JNZB003鑒定為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株JNZB005、JNZB009鑒定為冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum），菌株JNZB015鑒定為肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）。

2.4 腸膜明串珠菌JNZB003的生長(zhǎng)特性分析

同種微生物因來(lái)源不同，在某些特性上存在一定的差異。因此，對(duì)既具有民族地方特色又是新菌源分離的腸膜明串珠菌JNZB003的生長(zhǎng)特性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 腸膜明串珠菌JNZB003的生長(zhǎng)特性Fig.5 Growth characteristic of Leuconostoc mesenteroides JNZB003

由圖5A可知，腸膜明串珠菌JNZB003的生長(zhǎng)溫度范圍較寬，在25～30 ℃范圍內(nèi)均能良好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。

由圖5B可知，隨著NaCl含量的增加，腸膜明串珠菌JNZB003生長(zhǎng)能力逐漸減弱，當(dāng)NaCl含量為8%時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)NaCl含量達(dá)到10%時(shí)，菌株微弱生長(zhǎng)。朝鮮族泡菜含鹽量一般在8%～10%，表明此菌在這個(gè)環(huán)境條件下有活性。

由圖5C可知，腸膜明串珠菌JNZB003具有良好的生長(zhǎng)特性，培養(yǎng)0～6 h，為遲滯期；培養(yǎng)6～14 h，為對(duì)數(shù)期；培養(yǎng)14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)OD600nm值達(dá)到1.52；培養(yǎng)48 h時(shí)，OD600nm值最高，達(dá)1.91，之后OD600nm值開(kāi)始緩慢降低，進(jìn)入衰減期。

由圖5D可知，腸膜明串珠菌JNZB003產(chǎn)酸較快，培養(yǎng)12 h時(shí)，pH值降至4.60；培養(yǎng)24 h時(shí)，pH值降至4.16；培養(yǎng)28 h時(shí)，pH值降至3.98；培養(yǎng)28 h后，pH趨于穩(wěn)定。產(chǎn)酸快，影響發(fā)酵程度及產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)，且能抑制雜菌生長(zhǎng)。

由圖5E可知，腸膜明串珠菌JNZB003的最適生長(zhǎng)pH值為6.0。當(dāng)pH值＜4.0和pH值＞10.0時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)pH值為2.0和11.0時(shí)，菌株也能微弱生長(zhǎng)，說(shuō)明此菌耐酸堿性能較好。

3 結(jié)論

本研究從具有民族特色的延邊朝鮮族地區(qū)采集24份傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜，從中分離篩選出4株具有降解亞硝酸鹽功能的疑似腸膜明串珠菌。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA序列分析鑒定菌株JNZB003為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株JNZB005、JNZB009為冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum），菌株JNZB015為肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）。腸膜明串珠菌JNZB003在含150 μg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時(shí)，亞硝酸鹽降解率高達(dá)95.92%，其最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最適生長(zhǎng)pH值為6.0，培養(yǎng)14 h生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)12 h pH值降至4.60，當(dāng)NaCl含量為8%和pH值為3～10時(shí)，能夠生長(zhǎng)，具有良好的降解亞硝酸鹽能力、生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸能力，且耐鹽和耐酸堿。