郭志鵬，夏學森，黃文琪，2，吳振強

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.江門市泛亞生物工程與健康研究院，廣東 江門 529000）

蛋白飼料是水產(chǎn)、禽畜養(yǎng)殖的重要資源，目前，世界各國對飼料蛋白的需求量都很大，而魚粉等傳統(tǒng)蛋白飼料價格正在提高，尋找潛在的、優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料是目前養(yǎng)殖業(yè)的重要目標之一。因此，優(yōu)化飼料配方、降低飼料成本是養(yǎng)殖業(yè)重要的研究問題[1-2]。

辣木是一種尚未充分開發(fā)的多功能新型材料，具有產(chǎn)量高、適應性廣、栽培簡便、抗逆性強等特點。辣木籽在生產(chǎn)辣木油后，剩余的辣木籽粕如果未被充分利用就被丟棄，會造成環(huán)境污染和巨大的浪費。辣木籽粕本身有較高的粗蛋白含量（25%～36%），但植物原料常常含有抗營養(yǎng)因子，直接作為飼料難以被消化，甚至可能導致幼崽死亡。許多微生物具有豐富的酶系，可以降解、轉(zhuǎn)化糟粕類廢渣，廢渣經(jīng)過益生菌發(fā)酵處理后，能夠顯著增加其中的有益活性代謝產(chǎn)物[3-8]，如維生素、氨基酸、小肽等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，降解抗營養(yǎng)因子[9-10]，提高發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價值和口感風味[11-13]，延長飼料的貯存期，通過飼喂發(fā)酵飼料，可改善動物腸道微生物生態(tài)，維持腸道pH穩(wěn)定，同時降低生產(chǎn)成本，是理想的開發(fā)辣木籽粕的方法。辣木籽作為飼料可提高肉雞的肉脂、能量、多不飽和脂肪酸[14-15]，直接利用辣木葉[16-17]、辣木籽作為飼料或者將辣木葉用于制作青貯飼料的報道較多，但開發(fā)利用辣木籽粕固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的報道較少。

利用屎腸球菌、黑曲霉和米根霉對辣木籽粕進行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計對其接種順序、發(fā)酵培養(yǎng)基含水量、接種量和發(fā)酵時間進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了開發(fā)利用辣木籽粕生產(chǎn)發(fā)酵蛋白飼料的最佳工藝，以期為開發(fā)利用辣木籽粕提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽粕（使用前經(jīng)過粉碎，粗蛋白含量35.38%，酸溶蛋白含量5.10%）：由天源利生物科技（廣州）有限公司提供。

屎腸球菌（Enterococcus faecium）A1（美國國家生物信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）登錄號MN474019），米根霉（Rhizopus oryzae）E20360（NCBI登錄號MK267423），黑曲霉（Aspergillus niger）B1（NCBI登錄號MN474007）：均為前期試驗分離得到。

MRS培養(yǎng)基（制作平板時添加2%瓊脂），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（制作平板時添加2%瓊脂）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（辣木籽粕，根據(jù)試驗條件，加入蒸餾水調(diào)整含水量，121 ℃滅菌20 min）。

五水硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：廣州化學試劑廠；硫酸鉀、硼酸（均為分析純）：致遠化工天津有限公司；三氯乙酸（分析純）：上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Autoclave SP510高溫滅菌鍋：日本Yamato科技有限公司；SW-CK-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150B培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；KDN-1自動凱氏定氮儀：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

在無菌操作下，挑取米根霉、黑曲霉一環(huán)，分別接種到PDA培養(yǎng)基上；挑取屎腸球菌一環(huán)接種到MRS培養(yǎng)基上。30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.2 菌種擴大培養(yǎng)

米根霉、黑曲霉擴大培養(yǎng)：配制PDA液體培養(yǎng)基，分裝于250mL帶擋板的三角瓶（每瓶50 mL培養(yǎng)基），滅菌后分別接種活化后的米根霉、黑曲霉，30 ℃分別培養(yǎng)12 h、24 h；屎腸球菌擴大培養(yǎng)：配制MRS培養(yǎng)基，分裝于250 mL三角瓶（每瓶50 mL培養(yǎng)基），滅菌后接種活化后的屎腸球菌，37 ℃培養(yǎng)14 h。根據(jù)前期試驗結(jié)果，米根霉、黑曲霉和屎腸球菌分別培養(yǎng)12 h、24 h和14 h后，菌種到達對數(shù)生長期，有利于適應固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基環(huán)境。

1.3.3 培養(yǎng)條件對辣木籽粕發(fā)酵轉(zhuǎn)化的影響

基本發(fā)酵條件：稱取一定量辣木籽粕于250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水調(diào)整含水量，使發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量為40 g。121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫，在無菌條件下接種種子液（各種子液接種比例為1∶1∶1），30 ℃培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，45 ℃烘干，磨粉，測定粗蛋白和酸溶蛋白含量、酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性。

在上述發(fā)酵條件下進行單因素試驗，研究接種順序（①先接種屎腸球菌，發(fā)酵一半時間后接種米根霉和黑曲霉；②先接種米根霉和黑曲霉，發(fā)酵一半時間后接種屎腸球菌；③同時接種屎腸球菌、米根霉和黑曲霉）、培養(yǎng)基含水量（20%、30%、40%、50%、60%）、接種量（10%、15%、20%、25%、30%）和發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）對辣木籽粕發(fā)酵后粗蛋白和酸溶蛋白含量、酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性的影響。各組試驗重復3次。

1.3.4 工藝條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，接種順序、含水量、接種量和發(fā)酵時間以表1水平進行L9（34）的正交試驗。

表1 辣木籽粕發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Moringa oleifera seed meal

1.3.5 測定方法

粗蛋白的測定：改良的凱氏定氮法[18]，在消解步驟中加入過氧化氫加快消解過程。

酸溶蛋白的測定[19]：稱取1.00 g樣品加入燒杯，加入50 mL 15%三氯乙酸，超聲振蕩提取15 min。提取液過濾后，取10 mL提取液用上述改良的凱氏定氮法測定樣品酸溶蛋白含量。

蛋白酶活性測定[20]：測定酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性使用了福林酚法。在一定溫度（40±0.2）℃和相應的pH條件下（酸性蛋白酶為pH 3.0，中性蛋白酶為pH 7.2），定義在1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生相當于1 μg酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表示）的酶量為1個酶活單位，以U表示。

1.3.6 統(tǒng)計學分析方法

各指標采用了SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行了極差分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種順序?qū)蹦咀哑缮镛D(zhuǎn)化的影響

由圖1可知，接種順序?qū)λ崛艿鞍?、酸性蛋白酶和中性蛋白酶有顯著影響（P＜0.05），對粗蛋白含量影響不顯著（P＞0.05）。先接種霉菌時，各指標均達到最高值，粗蛋白和酸溶蛋白分別達到44.39%和8.25%，酸性蛋白酶與中性蛋白酶活性分別為103.12 U/g和528.44 U/g。米根霉、黑曲霉具有豐富的酶系，可將原料的大分子化合物降解為易消化的小分子化合物，也可以利用分解得到的小分子化合物合成新的生物大分子，有利于提高材料的營養(yǎng)價值，也為后續(xù)接種屎腸球菌提供了營養(yǎng)豐富的環(huán)境。接種順序?qū)Υ值鞍淄獾?個指標均有顯著影響，因此選擇先接種黑曲霉和米根霉，發(fā)酵一半時間后，再接種屎腸球菌進行后續(xù)試驗。

圖1 接種順序?qū)蹦咀哑缮镛D(zhuǎn)化的影響Fig.1 Effect of inoculation order on biotransformation of Moringa oleifera seed meal

2.2 培養(yǎng)基含水量對辣木籽粕生物轉(zhuǎn)化的影響

圖2 含水量對辣木籽粕生物轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of water content on biotransformation of Moringa oleifera seed meal

由圖2可知，培養(yǎng)基含水量對4個指標均有顯著影響（P＜0.05）。當含水量為40%時，粗蛋白含量達到最高值44.55%；當含水量為50%時，酸溶蛋白含量達到最高值9.22%；當含水量為30%時，酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性達到最高值，分別為161.47 U/g和711.82 U/g。在固態(tài)發(fā)酵中，傳質(zhì)依賴于培養(yǎng)基的自由水，當含水量較低時，自由水不足，傳質(zhì)效率較低，會阻礙微生物的生長，當含水量較高，發(fā)酵培養(yǎng)基的孔隙率降低，溶氧下降，會抑制霉菌的生長。因此選擇含水量30%、40%、50%進行后續(xù)試驗。

2.3 接種量對辣木籽粕生物轉(zhuǎn)化的影響

圖3 接種量對辣木籽粕生物轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of inoculum on biotransformation of Moringa oleifera seed meal

由圖3可知，接種量對4個指標均有顯著影響（P＜0.05）。在接種量為20%時，粗蛋白和酸溶蛋白含量均達到最高值，分別為42.11%和11.80%；當接種量為15%時，酸性蛋白酶和中性蛋白酶均達到最高值，分別為107.34 U/g和565.14 U/g。當接種量較低，微生物酶解發(fā)酵底物的起始效率較低，需要更多的時間生長繁殖才能對底物有較高的利用效率。隨著接種量的提高，培養(yǎng)基微生物量達到峰值的時間逐步縮短，不僅可以提高效率，而且由于接種微生物具有較大的生長優(yōu)勢，可以減少污染雜菌的機會。當接種量過大，微生物生長過快會導致發(fā)酵底物營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，代謝產(chǎn)物堆積，酶活性下降，過早進入衰亡期，微生物大量死亡，代謝效率下降。因此選擇接種量15%、20%、25%進行后續(xù)試驗。

2.4 發(fā)酵時間對辣木籽粕生物轉(zhuǎn)化的影響

圖4 發(fā)酵時間對辣木籽粕生物轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of fermentation time on biotransformation of Moringa oleifera seed meal

由圖4可知，發(fā)酵時間對4個指標均有顯著影響（P＜0.05）。在發(fā)酵時間為2 d時，粗蛋白和酸溶蛋白達到最高值，分別為43.07%和9.44%；當發(fā)酵時間為3 d時，酸性蛋白酶和中性蛋白酶達到最高值，分別為158.72 U/g和524.77 U/g。隨著發(fā)酵時間的延長，微生物合成代謝產(chǎn)物逐步積累，但后期又再下降，推測是在發(fā)酵后期，微生物以分解代謝為主導，隨著微生物數(shù)量的增多，代謝產(chǎn)物不斷積累，微生物代謝受到抑制，酶活開始下降。因此選擇發(fā)酵時間1 d、2 d、3 d進行后續(xù)試驗。

2.5 工藝條件優(yōu)化正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇接種順序（A）、發(fā)酵培養(yǎng)基含水量（B）、接種量（C）和發(fā)酵時間（D）等4個因素進行L9（34）正交試驗考察發(fā)酵條件對辣木籽粕發(fā)酵前后兩種蛋白含量和兩種蛋白酶活性的影響，正交試驗結(jié)果與分析見表2，極差分析見表3，方差分析見表4。

表2 辣木籽粕發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Moringa oleifera seed meal

表3 正交試驗結(jié)果極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiments results

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，對于因素A和因素C，直接取A2、C2水平。根據(jù)綜合平衡法，因素B、因素D分別選取B3、D3水平。因此，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)組合為A2B3C2D3，即先接種米根霉和黑曲霉，發(fā)酵36 h后接種屎腸球菌，培養(yǎng)基含水量50%，接種量20%（接種比例1∶1∶1），30 ℃條件下發(fā)酵3 d。該組合進行驗證試驗（重復3次），與未發(fā)酵的辣木籽粕相比，得到的發(fā)酵辣木籽粕粗蛋白含量為46.78%，提高了32.22%；酸溶蛋白含量為11.30%，提高了121.57%；酸性蛋白酶活性為77.06 U/g，中性蛋白酶活性為711.93 U/g。除酸性蛋白酶活性較低外，粗蛋白含量、中性蛋白酶活性與正交試驗對應指標最高值（分別為43.86%和849.74 U/g）無顯著差異（P＞0.05），酸溶蛋白含量顯著高于第4組（為6.65%）（P＜0.05），除酸性蛋白酶活性較低外，其余指標均達到該指標的最高水平，該組合為較優(yōu)組合。

由方差分析（見表4）可知，在正交試驗條件范圍內(nèi)，4個因素對粗蛋白沒有顯著影響（P＞0.05）；接種順序與發(fā)酵時間對酸溶蛋白有顯著影響（P＜0.05），發(fā)酵培養(yǎng)基含水量和接種量對酸溶蛋白無顯著影響（P＞0.05）；接種順序、接種量和發(fā)酵時間對酸性蛋白酶有顯著性影響（P＜0.05），含水量對酸性蛋白酶無顯著影響（P＞0.05）；接種順序、含水量和發(fā)酵時間對中性蛋白酶具有顯著性影響（P＜0.05），接種量對中性蛋白酶無顯著性影響（P＞0.05），與極差分析結(jié)果相符。

3 結(jié)論

屎腸球菌、米根霉和黑曲霉混菌發(fā)酵辣木籽粕可提高其粗蛋白及酸溶蛋白含量，菌種接種順序?qū)Πl(fā)酵效果有顯著影響，最佳條件為先接種黑曲霉和米根霉，發(fā)酵36 h后，再接種屎腸球菌，在培養(yǎng)基含水量50%，總接種量20%的條件下30 ℃發(fā)酵3 d。與未發(fā)酵的辣木籽粕相比，發(fā)酵后辣木籽粕粗蛋白達46.78%，提高了32.22%，酸溶蛋白達11.30%，提高了121.57%，同時酸性蛋白酶活性達77.06 U/g，中性蛋白酶活性達711.93 U/g?？梢姡l(fā)酵辣木籽粕綜合營養(yǎng)價值得到提高，具有更好的消化性能。該結(jié)果為辣木籽粕深加工開發(fā)提供了依據(jù)。