張芮瑞，邱樹毅，周少奇，王雪酈，3

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州科學(xué)院，貴州 貴陽 550001；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

磷是除氮外限制植物生長的第二營養(yǎng)元素，在光合作用等過程中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。由于土壤中有效磷的缺乏，速效磷肥被大量使用，而絕大部分的磷肥進入土壤后與Ca2+等金屬離子結(jié)合形成Ca3（PO4）2等難溶性磷，難以被植物吸收利用[3-4]。既造成有限磷礦資源大量浪費，還加劇農(nóng)業(yè)資源污染問題[5]。好氧堆肥法能在一定程度上緩解肥料緊缺和環(huán)境污染方面的壓力，而解磷微生物菌劑的加入，不但可以加快肥料的腐熟，還可以促進磷素的轉(zhuǎn)化，提高肥效[6]。

目前，大量的解磷微生物相關(guān)的研究成果已被先后報道，解磷細菌主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和洋蔥伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）等[7-11]；解磷真菌主要為青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）等[12-15]。實際上，解磷微生物的溶磷過程極其復(fù)雜，并非其中單一的某一因素起所有作用，而是多種因素共同作用的結(jié)果[16]。有關(guān)解磷微生物溶磷培養(yǎng)條件的優(yōu)化早有研究[10，15]，獲得了大量研究成果。除簡單的單因素優(yōu)化的研究外，也有采用正交法或者響應(yīng)面法等進行進一步優(yōu)化實驗的相關(guān)研究，從而盡多的探究更多因素對解磷微生物解磷條件的影響[17-18]。但上述所涉及的研究內(nèi)容基本為非高溫解磷微生物，并不適用于好氧堆肥下的高溫條件。目前國內(nèi)外對于耐高溫解磷微生物的研究相對較少，其中對耐高溫解磷真菌的研究更為稀缺。

本實驗早期篩選獲得的溶磷效果較好的耐高溫解磷真菌菌株GDF1，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗，調(diào)整碳源、氮源等培養(yǎng)條件，探究解磷菌株解磷效果最佳時的溶磷條件，以期為GDF1菌株投入高效微生物菌肥的生產(chǎn)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

耐高溫解磷真菌GDF1為本實驗室從白酒丟糟高溫堆肥樣品中篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機磷發(fā)酵液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g；蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。其中Ca3（PO4）2需與其他藥品分開滅菌后再混合。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.8～6.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-CJ-IFD型超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；THZ-82數(shù)顯恒溫氣浴振蕩器：天津賽得里斯實驗分析儀器制造廠；101-1AB電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀：美谷分子儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋、BMJ-250C培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA-2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 解磷能力測定

將充分活化后的出發(fā)菌株GDF1接種于PDA培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)數(shù)天至菌落布滿整個平板，加無菌水洗脫并用脫脂棉過濾，制備孢子懸浮液，經(jīng)鏡檢孢子量約為1×107CFU/mL。

將孢子懸浮液以1%接種量接入無機磷液體培養(yǎng)基中，并以1%無菌水代替1%孢子懸浮液作空白對照，重復(fù)3次，作為平行。置于50 ℃、180 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)5 d后取出，10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后采用鉬銻抗比色法[16]測定發(fā)酵上清液中的磷含量。以波長700 nm處測定吸光度值（OD700nm值）（y）為縱坐標(biāo)，溶磷量（x）為橫坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鉬銻抗磷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.300 5x+3×10-6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，通過磷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算溶液中有效磷含量，以確定菌株的解磷能力。

1.3.2 解磷條件優(yōu)化

（1）碳氮源種類的優(yōu)化

碳源種類的優(yōu)化：分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖及甘露醇為唯一碳源（10.0 g/L），其他培養(yǎng)基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同碳源種類對其解磷能力的影響。

氮源種類的優(yōu)化：分別以硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、乙酸銨及氯化銨為唯一氮源（0.5 g/L），其他培養(yǎng)基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同氮源種類對其解磷能力的影響。

（2）碳氮源、無機鹽及磷源濃度的優(yōu)化

碳源濃度的優(yōu)化：以最優(yōu)種類碳源為唯一碳源，質(zhì)量濃度分別為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同碳源濃度對其解磷能力的影響。

氮源濃度的優(yōu)化：以最優(yōu)種類氮源為唯一氮源，質(zhì)量濃度分別為0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進行解磷能力的測定，研究不同氮源濃度對其解磷能力的影響。

無機鹽濃度的優(yōu)化：以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O為無機鹽組合，總質(zhì)量濃度分別為0.48 g/L、0.96 g/L、1.44 g/L、1.92 g/L、2.40 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同無機鹽濃度對其解磷能力的影響。

磷源濃度的優(yōu)化：以磷酸三鈣（Ca3（PO4）2）為唯一磷源，質(zhì)量濃度分別為2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L，其他培養(yǎng)基成分不變，進行解磷能力的測定，探究不同磷源濃度對其解磷能力的影響。

（3）響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取碳源質(zhì)量濃度（A）、草酸銨質(zhì)量濃度（B）、無機鹽濃度（C）及磷酸三鈣質(zhì)量濃度（D）為自變量，以GDF1的溶磷量為響應(yīng)值，對其解磷條件進行優(yōu)化，利用各因素兩兩交互響應(yīng)面、等高線以及響應(yīng)面回歸模型進行優(yōu)化，找出GDF1出現(xiàn)最大溶磷量所對應(yīng)各因素的最優(yōu)值，并進行驗證試驗。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 溶磷條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for phosphorus-solubilizing conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮源種類的優(yōu)化

分別以10 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖及甘露醇作為碳源進行液體發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源種類的篩選。試驗結(jié)果表明，不同碳源對菌株GDF1溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為蔗糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞甘露醇＞果糖＞乳糖，GDF1利用蔗糖作為碳源表現(xiàn)出更好的解磷能力，溶磷量為221.76 mg/L。

圖1 碳源（a）和氮源（b）種類對菌株GDF1溶磷能力的影響Fig.1 Effect of carbon source (a) and nitrogen source (b) type on the phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1

分別以0.5 g/L硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、乙酸銨及氯化銨作為氮源進行液體發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源種類的篩選。試驗結(jié)果表明，不同氮源對菌株GDF1溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為草酸銨＞硫酸銨＞氯化銨＞硝酸鈉＞乙酸銨＞硝酸銨，GDF1利用草酸銨作為碳源表現(xiàn)出更好的解磷能力，溶磷量為227.46 mg/L。

由以上試驗結(jié)果可得，GDF1的解磷培養(yǎng)基中最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為草酸銨。

2.2 碳氮源、無機鹽及磷源濃度的優(yōu)化

以蔗糖為唯一碳源，培養(yǎng)基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結(jié)果表明，隨著蔗糖質(zhì)量濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到10 g/L時，溶磷量最高，為228.33 mg/L。該結(jié)果趨勢與前人研究結(jié)果類似[19-20]，即不同的解磷微生物各自存在一個最適碳源濃度，在低于該值的范圍內(nèi)解磷微生物的解磷能力會隨著碳源濃度的增加而增大，而一旦超過這個值，解磷微生物的解磷能力就會開始逐漸下降。

圖2 蔗糖（a）、草酸銨（b）、無機鹽（c）及磷酸三鈣（d）質(zhì)量濃度對菌株GDF1溶磷能力的影響Fig.2 Effect of sucrose (a),ammonium oxalate (b),inorganic salt (c)and tricalcium phosphate (d) concentration on phosphorussolubilizing ability of strain GDF1

以草酸銨為唯一氮源，培養(yǎng)基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結(jié)果表明，隨著草酸銨濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到0.5 g/L時，溶磷量最高，為227.83 mg/L。氮源作為培養(yǎng)基組成的重要成分，在合適的濃度下，能促進解磷微生物的繁殖生長，從而加快磷轉(zhuǎn)化的進程，發(fā)酵液中的溶磷量隨之上升，但濃度過高時可能培養(yǎng)到后期會影響培養(yǎng)基的pH值，從而對微生物生長產(chǎn)生不利影響，而導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶磷量下降。

以NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O及MnSO4·4H2O為無機鹽組合，培養(yǎng)基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結(jié)果表明，隨著無機鹽質(zhì)量濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到0.96 g/L時，溶磷量最高，為228.32 mg/L。這種趨勢的出現(xiàn)推測可能與解磷微生物溶磷機制中的金屬離子的螯合作用機制有關(guān)。

以磷酸三鈣為唯一磷源，培養(yǎng)基其他成分不變，進行解磷能力的測定。結(jié)果表明，隨著磷酸三鈣質(zhì)量濃度增加，溶磷量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到10.0g/L時，溶磷量最高，為237.81 mg/L。該趨勢可能是由于當(dāng)難溶性磷濃度低的時候，菌株GDF1可以利用轉(zhuǎn)化的磷原料少，所以發(fā)酵液中的溶磷量較少；隨著磷酸三鈣的增加GDF1可轉(zhuǎn)化的難溶性磷原料增加，發(fā)酵液中的溶磷量也隨之增加并達到最大值；而當(dāng)磷酸三鈣濃度過高的時候，可能會對GDF1的生長繁殖有抑制作用，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶磷量下降。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

運用根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，通過蔗糖質(zhì)量濃度（A）、草酸銨質(zhì)量濃度（B）、無機鹽質(zhì)量濃度（C）和磷酸三鈣質(zhì)量濃度（D）進行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。以溶磷量（R）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 溶磷條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for phosphorus-solubilizing conditions optimization

續(xù)表

2.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，以R為溶磷量，A、B、C和D分別對應(yīng)蔗糖、草酸銨、無機鹽和磷酸三鈣的編碼。得到二次多項回歸方程：

對于上述回歸模型進行方差分析，并對模型系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

由表3方差分析結(jié)果可知，模型的F=95.03，P＜0.000 1差異極顯著，并且失擬項P=0.672 5＞0.05，故說明該模型是顯著的。模型的決定系數(shù)R2=0.989 6，說明擬合程度很好，且調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.979 2，預(yù)測決定系數(shù)R2pre=0.955 1，方差相差很小，說明可信度高，可以用此模型來分析和預(yù)測溶磷量最優(yōu)提取工藝。蔗糖、草酸銨和磷酸三鈣對溶磷量影響均顯著（P＜0.05），無機鹽對溶磷量影響不顯著（P＞0.05）；因素對溶磷量影響程度為D＞B＞A＞C。對于交互作用來說，蔗糖和草酸銨、蔗糖和磷酸三鈣、草酸銨和磷酸三鈣以及無機鹽和磷酸三鈣交互作用對溶磷量的影響顯著（P＜0.05），蔗糖和無機鹽以及草酸銨和無機鹽交互作用對溶磷量的影響不顯著（P＞0.05），對于模型的二次項來說均極顯著。

2.3.3 響應(yīng)面結(jié)果及分析

響應(yīng)面優(yōu)化模型各因素（蔗糖、草酸銨、無機鹽和磷酸三鈣）兩兩交互作用對溶磷量影響的響應(yīng)面和等高線見圖3。

圖3 各因素交互作用對菌株GDF1溶磷能力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on phosphorus-solubilizing ability of strain GDF1

由圖3分析可知，蔗糖和草酸銨交互作用對溶磷量影響的等高線圖為橢圓形，說明蔗糖和草酸銨交互作用對溶磷量影響的顯著。當(dāng)草酸銨不變時，隨著蔗糖的增加，溶磷量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；同樣，當(dāng)蔗糖不變時，隨著草酸銨增加，溶磷量也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。蔗糖和無機鹽以及草酸銨和無機鹽交互作用對溶磷量的影響的等高線圖都接近圓形，說明對結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05）。蔗糖和磷酸三鈣間交互作用對溶磷量的影響的等高線圖為橢圓形，且由圖3可以看出，結(jié)果隨著因素的改變的變化明顯，說明此因素交互作用對結(jié)果的影響顯著。草酸銨和磷酸三鈣以及無機鹽和磷酸三鈣交互作用對溶磷量的影響的等高線圖為較扁的橢圓形，說明對溶磷量的影響較為顯著，隨著因素的增加，溶磷量先增加，達到最大值后出現(xiàn)下降。

響應(yīng)面圖均為開口向下的凸面，故響應(yīng)值R存在極大值，為進一步優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件得出在蔗糖、草酸銨、無機鹽和磷酸三鈣交互影響下，最優(yōu)提取工藝為：蔗糖為10.65 g/L，草酸銨為0.61 g/L，無機鹽為1.02 g/L，磷酸三鈣為10.70 g/L。在此條件下模型預(yù)測的溶磷量為291.35 mg/L。

2.3.4 驗證試驗

為了方便實際操作，修改溶磷條件為蔗糖10.7 g/L，草酸銨0.6 g/L，無機鹽1.0 g/L，磷酸三鈣10.7 g/L。在此條件下進行驗證測試，經(jīng)過3輪重復(fù)驗證，驗證組中測得的溶解磷量實際值為292.59 mg/L，與預(yù)測值291.35 mg/L接近，該結(jié)果說明此模型具有較好的可信度，可用于后續(xù)研究。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明不同種類的碳源和氮源會影響菌株GDF1的溶磷效果，通過單因素試驗設(shè)計及響應(yīng)面試驗先后對菌株GDF1 的溶磷條件進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，耐高溫菌株GDF1的最佳解磷條件為：蔗糖10.7 g/L，草酸銨0.6 g/L，無機鹽1.0 g/L，磷酸三鈣10.7 g/L。在此優(yōu)化條件下，實際驗證溶磷量為292.59 mg/L。本試驗中的菌株GDF1是耐高溫解磷真菌，經(jīng)優(yōu)化后，在耐高溫解磷微生物中解磷性能表現(xiàn)良好，可作為耐高溫微生物制劑的潛在原料，為推動耐高溫解磷微生物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。