高占爭，吳正云，張文學

（1.四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.四川水井坊股份有限公司，四川 成都 610037）

多菌自然發(fā)酵是中國白酒的一大特色[1]。濃香型白酒除了糟醅、大曲的多菌種自然發(fā)酵外，還包括泥窖的窖泥中多種微生物的作用。而且泥窖是濃香型曲酒釀制之本，老窖是產(chǎn)好酒的最根本條件[2]。泥窖的窖泥中存在多種微生物，經(jīng)過長時間持續(xù)不斷地生產(chǎn)活動，形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[3]，這些微生物以窖泥為基地，不僅自身代謝產(chǎn)生的一些物質會進入糟醅中，而且會通過黃水進入糟醅中進行代謝活動[4]，其中的一些代謝物質（如己酸、己酸乙酯等）會通過糟醅蒸餾進入酒中，成為濃香型白酒的關鍵風味物質，進而影響濃香型白酒的質量和風格[5]。因此研究窖泥微生物，可以進一步弄清楚白酒多菌種自然發(fā)酵原理，對提高濃香型白酒質量具有重要意義。

1 基于傳統(tǒng)微生物技術對窖泥微生物的認識

對窖泥中微生物的重要性的認識始于20世紀60年代，1964年在茅臺窖池底部的窖泥中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)丁酸和己酸的梭狀芽孢桿菌，最終證明了己酸乙酯的確是窖底香味成分，并對濃香型白酒發(fā)展起到了促進作用[6]。由此拉開了窖泥微生物研究的序幕。隨后吳衍庸等[7-11]對濃香型白酒窖泥微生物進行了深入研究，包括不同窖齡酒窖窖泥細菌數(shù)量分布，各類厭氧細菌在不同窖泥中的數(shù)量分布，釀酒功能菌的分離鑒定以及利用功能菌制作人工窖泥等。其中對己酸梭菌、甲烷菌等作了重點研究，也取得了很多非常有意義的成果。就己酸菌來說，內蒙古輕工科學研究所首先從濃香型白酒窖池窖泥中分離得到梭菌[12]。一些有代表性的菌株有：吳衍庸等[13-14]從五糧液與瀘州老窖窖泥中分離的產(chǎn)己酸梭菌被命名為盧型梭菌（后經(jīng)鑒定為巴氏梭菌（Clostridium barkeri）；徐占成等[15]從劍南春集團窖泥中分離到耳渦形梭菌（Clostridium cochleatum）；黑龍江省輕工所的黑輕80#己酸菌[16]，遼寧大學的L-Ⅱ等[17]，這幾種菌雖然都產(chǎn)己酸但生理生化性質不同。從五糧液和瀘州老窖窖泥分離的梭菌，兼性厭氧，利用乙醇和乙酸鹽合成己酸，產(chǎn)生少量乙酸、丁酸，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生少量丁酸[13-14]。克氏梭菌不利用葡萄糖，利用乙醇和乙酸生成丁酸和己酸，嚴格厭氧。耳渦形梭菌嚴格厭氧，在改良的巴氏培養(yǎng)基或厭氧培養(yǎng)基中，發(fā)酵生成正丁醇、丁酸與己酸[15]。甲烷菌也是窖泥中重要的功能微生物，目前的研究已證明，老窖窖泥的甲烷菌數(shù)量明顯多于新窖，可作為老窖一種指針菌。甲烷菌更重要的作用是與己酸菌和其他氫型發(fā)酵菌的相互耦聯(lián)關系，實現(xiàn)“種間氫轉移”，實驗與生產(chǎn)實踐都已證明甲烷菌與己酸共同發(fā)酵可以促進己酸的生成[18]。

2 基于PCR的分子生物學技術對窖泥微生物的認識

在窖泥微生物研究中，基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的分子生物學技術應用較為廣泛，目前應用較多的是變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術，此外還有技術核糖體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）擴增片段限制性內切酶分析（amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）等，構建16S rDNA/rRNA克隆文庫，再深度測序技術。這些技術的應用使得對窖泥微生物的認識從單一微生物到微生物群落的轉變。通過DGGE等技術認識到窖泥中除了有細菌外，還有古菌和真菌，見表1。

表1 基于PCR-DGGE等技術的窖泥微生物群落結構Table 1 Microbial community structure in pit mud based on PCR-DGGE and other techniques

由表1可知，不論是新窖泥還是老窖泥，厚壁菌門微生物始終是優(yōu)勢微生物。在新窖泥中一般是乳桿菌目（Lactobacillales）和芽孢桿菌目（Bacillales）為優(yōu)勢微生物，而老窖泥中為（梭菌目Clostridiales）。而且隨著窖泥的老熟，Lactobacillales和Bacillales的豐度逐漸減少，而Clostridiales的豐度逐漸增加。窖泥中的古菌主要是甲烷菌，有氫營養(yǎng)性和乙酸營養(yǎng)性的甲烷菌，而且隨著窖泥的老熟甲烷菌的豐度也是逐漸增加的。窖泥微生物的Shannon（香農）多樣性指數(shù)多在1.50～3.00。

至于真菌，窖泥的數(shù)量較少，有研究發(fā)現(xiàn)，有四個門，子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和壺菌門（Chytridiomycota），Ascomycota為優(yōu)勢微生物，新窖泥中根霉（Rhizopus）、莖點霉（Phoma）和絲孢酵母屬（Trichosporon）豐度較高，老窖泥中曲霉（Aspergillus）和假絲酵母（Candida）豐度較高。Candida在窖泥老熟過程中豐度增加明顯。

以上可以看出，DGGE技術的應用確實加深窖泥微生物群落的認識，但是DGGE技術本身的缺點，限制了其進一步的應用。DGGE技術的信息量較少[27]，這也能從窖泥微生物多樣性Shannon指數(shù)看出，最高只能到3.00左右，對微生物群落的認識還不全面，只能認識到一些豐度非常高的微生物，而且不能同時對細菌、真菌、古細菌進行分析。

隨著測序技術的發(fā)展和成本的降低，高通量測序技術在窖泥微生物中的應用是越來越廣泛。一般是先提取樣本總DNA，用引物進行PCR擴增，構建庫，然后對16S rDNA/rRNA的V3、V4等高變區(qū)序列進行高通量測序，見表2。

表2 基于16S rDNA/rRNA基因高通量測序的窖泥微生物群落Table 2 Microbial community in pit mud based on 16S rDNA/rRNA gene high throughput sequencing

續(xù)表

由表2可知，檢測到的微生物種群數(shù)量大大增加，一般獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目在400～700甚至更多，微生物的Shannon多樣性指數(shù)也一般在3.50～7.00，甚至更高。進一步明確了窖泥中占絕對優(yōu)勢的厚壁菌門微生物，其他優(yōu)勢微生物還有廣古菌門，擬桿菌門微生物等。優(yōu)質老熟窖泥的優(yōu)勢微生物，在綱水平一般為梭菌綱（Clostridia），在屬水平一般有梭菌屬（Clostridium）、己酸菌屬（Caproiciproducens）、沉積微生物屬（Sedimentibacter）、堿棒菌（Alkalibaculum）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）等。優(yōu)質老熟窖泥中的古菌一般為氫營養(yǎng)型的甲烷菌，甲烷桿菌屬（Methanobacterium），甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）。窖泥老熟過程中，產(chǎn)己酸的微生物豐度一般會逐漸增加（Clostridium、Caproiciproducens），甲烷菌Methano brevibacter豐度也會同步增加，而乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐度會逐漸下降。

以上研究中有相同點，但是也有很多不同的地方，不同地區(qū)、不同廠家的取樣地點、不同窖齡的窖泥樣品可能會對窖泥微生物的群落結構產(chǎn)生影響，但是窖泥測序中所用不同引物，也會對微生物的檢出有很大影響，如有細菌和古菌的通用引物（515F和806R），可以同時檢測出古菌和細菌，有細菌專用引物341F和806R，古菌專用引物519F和915R等。

3 基于組學技術對窖泥微生物的認識

以上研究中雖然對窖泥微生物的認識比傳統(tǒng)技術方法更加全面深刻，但是所用樣品的DNA都要經(jīng)過PCR擴增，在此過程中PCR擴增條件（如擴增效率、膠濃度、電泳條件等）以及PCR技術本身的缺陷（如很難檢出微生物總量低的微生物）[27]，都會對微生物群落的檢出及認識產(chǎn)生影響。因此為了進一步深入研究窖泥微生物，揭示窖泥老熟的機制，宏基因組學技術開始應用于窖泥微生物的研究。目前對窖泥微生物研究應用到的組學技術主要有宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白組學。宏基因組學和宏轉錄組學都是先提取窖泥中總DNA或RNA，不經(jīng)過PCR擴增，直接進行高通量測序，然后進行分析。宏基因組學可以研究某一環(huán)境條件下微生物群落的整體結構信息，而宏轉錄組學可以研究一定時期群體細胞轉錄的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型及拷貝數(shù)，既研究在特定時期、特定環(huán)境條件下所有活躍的微生物群體[38-39]。宏基因組學和宏轉錄組學除了研究微生物群落結構外，還可以預測研究群體微生物的各種功能，例如比較不同窖泥樣品中微生物特定功能基因的差別以及所表達酶的差別等。兩種技術分別從DNA和RNA水平更全面精細地展示整個群落的功能代謝譜和表達譜，進而從原理上闡明微生物群落在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的根本機制。

兩種技術在窖泥研究中都已經(jīng)開始應用。GUO M Y等[40]利用宏基因組學對不同地區(qū)不同窖齡窖泥研究發(fā)現(xiàn)，主要的微生物群落組成為：Firmicutes（54.6%），Euryarchaeota（15.3%），Bacteroidetes（10.1%），γ-變形菌門（Gammaproteobacteria 5.8%），后鞭毛生物（Opisthokonta 5.7%）和未分類細菌（Unclassified_Bacteria 2.3%）。在133個主要的屬中活躍的微生物有Lactobacillus、Sedimentibacter、Syntrophomonas、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、Methanobacterium、Bacillus、Clostridium、耐堿酵母屬（Galactomyces）、Candida、畢赤酵母屬（Pichia）、青霉菌屬（Penicillium）、Aspergillus，為合成濃香型白酒揮發(fā)性香味物質的主要微生物。Bacteroidetes在不同窖齡窖池中差別很大，窖齡越老，豐度越高。Euryarchaeota能顯著表現(xiàn)出酒的地理特征。

TAO Y等[41]利用宏基因組和高通量測序技術研究了25年和50年窖泥中活躍微生物，原核微生物為主占95.3%，而真核微生物豐度僅為1.8%。在所有的可讀宏基因組序列中，主要的原核微生物豐度分別為Firmicutes（擬桿菌門）48.0%，廣古菌門（Euryarchaeota）19.0%，Bacteroidetes13.5%，放線菌門（Actinobacteria）2.5%，變形菌門（Proteobacteria）2.1%。并結合16S rDNA和16S rRNA分析，Clostridial clusterIV，Lactobacillus，喜熱菌屬（Caloramator），Clostridium，Sedimentibacter，Bacteroides，卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）是活躍微生物。Clostridial clusterIV和Clostridium非?？赡軈⑴c了己酸和合成。在窖泥宏基因組中檢測到了通過擴鏈反應合成己酸的大部分酶的基因，還檢測到了氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型甲烷菌合成甲烷的關鍵酶基因，推測出己酸合成過程中存在種間氫轉移。

張倩穎[42]對老熟窖泥進行宏轉錄研究發(fā)現(xiàn)，窖泥中雖然廣古菌門（Euryarchaeota）的豐度低于厚壁菌門（Firmicutes），但是mRNA轉錄活性遠高于厚壁菌門；在屬水平mRNA轉錄活性較高的為甲烷囊菌屬與甲烷八疊球菌屬。在老熟窖泥微生物中，碳水化合物代謝最為活躍，主要由梭菌綱（Clostridia）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia）微生物參與。老熟窖泥中乳酸含量較低的重要原因是因為L-乳酸脫氫酶活性低，丙酮酸在老熟窖泥中代謝生產(chǎn)的乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）遠多于乳酸。而對于乳酸菌和合成來說，耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）有利于L-乳酸合成，而古甲烷八疊球菌屬和甲烷囊菌屬則有利于D-乳酸的合成。

張應剛[43]同時利用宏基因組學和宏轉錄組學對老熟窖泥研究發(fā)現(xiàn)如下：高表達物種有Methanoculleus、Clostridium、嗜蛋白質菌屬（Proteiniphilum）、Syntrophomonas和Lactobacillus。Lactobacillus的豐度雖然低，但是在窖泥中發(fā)揮了非常重要的作用。所有注釋到的產(chǎn)甲烷菌在窖泥中都是屬于活躍表達的。己酸的合成代謝在窖泥中非?；钴S。窖泥中存在大量與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌互營的，并且高表達的微生物：Syntrophomonas、互營熱菌屬（Syntrophothermus）和Syntrophaceticus。窖泥中存在以甲醇為底物合成甲烷的代謝途徑。

從以上研究可以看出，利用組學技術除了對微生物群落結構進行分析外，還對微生物群落的各種功能進行了研究。而對于宏轉錄組學來說，雖已應用，但是還存在技術難題，窖泥RNA的提取非常困難。窖泥成分復雜，富含腐殖質，而且主要以厭氧微生物為主，這些都可能是影響RNA的因素。特別是腐殖質對RNA的提取有很大的影響[44]。

蛋白質組學可以研究窖泥微生物的功能基因表達、特殊功能蛋白質開發(fā)以及生態(tài)元素循環(huán)等，應用較少，但開始有人利用此技術對窖泥微生態(tài)進行研究，如ZHENG Q等[45]首先從30年和300年的窖泥微生物中提取總蛋白質和DNA，然后利用基于iTRAQ蛋白組學技術研究微生物表達形成香味的功能蛋白質。在檢測到的63種表達功能香味成分的蛋白中，有59種在300年窖泥中高效表達。這些功能蛋白在己酸、丁酸和甲烷的代謝途徑中都有表達。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)Methanobacterium是一種非常重要的生成香味成分的微生物。

綜合以上研究可以看出，隨著新技術的發(fā)展和應用，窖泥中發(fā)現(xiàn)的微生物越來越多，窖泥是一個非常重要的微生物資源寶庫。老窖泥中的標志性優(yōu)勢微生物，在門水平為Firmicutes，Euryarchaeota，Bacteroidetes，在綱水平為梭菌綱Clostridia，在屬水平Clostridium、Sedimentibacter、Syntrophomonas、Methanobacterium，Methanobrevibacter等。甲烷菌除了對窖泥的老熟有促進作用外，對濃香型白酒的香味物質的生成也有重要作用。

4 環(huán)境因子對窖泥微生物的影響

以上的研究多是從窖泥本身的微生物群落結構的變化和功能進行研究。但是在窖池中，窖泥中的微生物是不斷受外界環(huán)境的影響的。長期受到這種環(huán)境影響，窖泥才能從新窖泥逐漸老熟，其中微生物也在不斷的變化中，從最初的群落結構，變成老熟狀態(tài)的群落結構。如果窖池維護不當，對窖泥有利的環(huán)境條件發(fā)生變化，窖泥就會出現(xiàn)退化，微生物群落結構也會發(fā)生改變。同時這種影響是相互的，窖泥微生物群落的不斷變化，其代謝產(chǎn)物也不斷影響窖池內糟醅中香味物質，最終會對酒質產(chǎn)生影響。

窖泥的環(huán)境因子包括水分、pH、酸度、腐殖質、有效鉀、有效磷、水解氮、有機酸等。LIU M K等[36]研究認為，pH值、己酸和丁酸與優(yōu)質窖泥的呈正相關性，而乳酸與較差的窖泥樣品呈正相關性。己酸與丁酸與Caproiciproducens和Clostridium的豐度具有非常明顯的正相關性，而與Lactobacillus和Bacillus的豐度有非常明顯的負相關性。乙酸與Rummeliibacillus、Sporolactobacillus的豐度呈負相關性。

陶勇等[46]認為環(huán)境因子中有效磷、氨氮、pH 對微生物群落結構的影響較大，其次是腐殖質，而水分含量的影響較小。而在另一研究中[34]，乳酸主要與1年窖泥樣品微生物呈正相關，而己酸與25年和50年窖泥樣品微生物呈正相關。水分、腐殖質、氮等與微生物群落變化的相關性不明顯。pH、NH+4與Bacteroidetes和Euryarchaeota正相關，而與厚壁菌門負相關；而乳酸與丁酸相反。pH、NH+4的增加與己酸含量的增加相一致，而與乳酸及Lactobacillus的豐度增加相反。

胡曉龍[47]的研究認為，窖泥中乳酸與水溶性有機碳含量及窖泥中乳酸菌（Lactobacillus及Pediococcus）的相對含量呈正相關，而大多數(shù)甲烷菌及梭菌綱微生物與窖泥中pH值呈現(xiàn)正相關。

5 存在的問題及展望

雖然利用分子生物學技術，對窖泥微生物的認識有了更多的了解，但還依然有很多問題沒有解決。

窖泥微生物群落結構和功能的關系依然不明確。窖泥微生物群落里面的微生物群落如何相互作用，又如何影響其功能，這是研究窖泥老熟的機制的前提和基礎，只有弄清楚了窖泥微生物的作用和功能，才能了解窖泥微生物群落從新窖泥如何逐漸適應環(huán)境變成老熟窖泥，才能了解窖泥老熟機制。

窖泥雖然是決定濃香型白酒風格的關鍵，但是窖泥到底如何影響白酒的香味成分，不是十分明確。濃香型白酒的關鍵香味物質，是在窖泥中合成然后進入糟醅，還是窖泥微生物通過黃水進入糟醅在合成香味物質，或者兩者兼而有之，這對白酒關鍵香味物質的生成非常重要，值得進一步研究。

在正常生產(chǎn)中，窖池窖泥長期處在厭氧、高二氧化碳濃度、富含乙醇、有機酸的環(huán)境下，這種環(huán)境對窖泥微生物應該有非常大的影響，正是這種環(huán)境造成了窖泥的逐步老熟。但是那種環(huán)境因子起什么作用，如何促進窖泥老熟，需要深入研究。

現(xiàn)在對窖泥的評價，依然沒有統(tǒng)一標準。在目前的生產(chǎn)中還是經(jīng)常以時間的長短、感官、產(chǎn)酒指標來判斷窖泥的好壞。但是這些判定都存在不確定性，沒有明確的界限，無法數(shù)據(jù)化，只能靠經(jīng)驗。這是因為窖泥的成熟過程受到窖泥樣品本身在窖池中的位置、狀態(tài)、時間長短、維護以及白酒生產(chǎn)工藝等各種因素的影響。有些學者也嘗試用一些理化指標來評價窖泥狀態(tài)，但依然有局限性[48-49]。如果明確了微生物在窖泥中的分布和功能，可以把微生物作為評價窖泥狀態(tài)的關鍵指標之一，更有利于對窖泥的評價。