歐海亞，葉小鵬，李 舒，劉嘉輝，鄺衛(wèi)紅

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院 深圳 518133；2. 廣東醫(yī)科大學(xué) 湛江 524000；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科 廣州 510080）

非酒精脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病，影響全世界約25%的成年人[1]，其特征是無(wú)大量飲酒和無(wú)其他明確的肝損害因素所致的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性。近年來(lái)，中國(guó)NAFLD 患病率逐年上升，并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。有研究顯示，我國(guó)城市地區(qū)和農(nóng)村地區(qū)的NAFLD患病率分別為21.83%和20.43%[2]。起初NAFLD 被認(rèn)為屬于良性疾病的一種，但隨著對(duì)該病不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 具有發(fā)展成為肝纖維化的可能性，并且與肝硬化、肝癌、肝衰竭等終末期肝病變密切相關(guān)，對(duì)公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3-4]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，治療措施主要以改變不良的生活習(xí)慣和控制代謝因素為主[1]，單一的治療方法難以取得理想的效果，若盲目進(jìn)行多藥物干預(yù)則可能會(huì)增加肝臟的負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種有效且作用途徑多樣化的防治方案，對(duì)治療該病以及降低NAFLD引起的肝臟終末期病變發(fā)生率具有重要的意義。而基于辯證論治，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床驗(yàn)證且具有多作用途徑優(yōu)勢(shì)的中藥復(fù)方無(wú)疑值得進(jìn)一步深入研究。

茵陳五苓散（Yinchenwuling Decotion，YCWLD）出自《金匱要略·黃疸病脈證并治第十五》，用于治療黃疸病（濕重于熱型），由茵陳、白術(shù)、茯苓、桂枝、澤瀉、豬苓組成，具有保肝利膽、抗炎、降血脂、改善胰島素抵抗等作用[5]，臨床研究表明，茵陳五苓散具有降低NAFLD 患者的γ-GT、ALT、ALP 及AST 等肝功能異常指標(biāo)，下調(diào)LDL-C、TC 及TG，升高HDL-C 從而調(diào)節(jié)脂代謝[6]，減輕腹部CT和B超等脂肪肝影像學(xué)改變，調(diào)節(jié)腸道腸桿菌、葡萄球菌數(shù)量、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌等腸道菌群的數(shù)量進(jìn)而改善NAFLD 患者的腸道菌群紊亂狀態(tài)等功能，從多個(gè)方面發(fā)揮治療NAFLD的作用[7-8]。

然而，目前研究多局限于某一作用靶點(diǎn)或某一通路來(lái)論述其作用機(jī)制，無(wú)法反映本方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，也未能從整體水平來(lái)闡述YCWLD 治療NAFLD 的機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析、生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、多向藥理學(xué)分析等多學(xué)科的研究方法和內(nèi)容，可以從單一靶標(biāo)、單一途徑的研究形式轉(zhuǎn)變?yōu)檎w、系統(tǒng)的形式探索藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的關(guān)聯(lián)，與中醫(yī)的整體觀一致，此研究方法融合了生物網(wǎng)絡(luò)及計(jì)算方法與實(shí)驗(yàn)方法,為研究復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)以及藥物開(kāi)發(fā)提供了思路[9-10]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以中藥、化合物、疾病靶點(diǎn)為研究對(duì)象，對(duì)YCWLD 治療NAFLD 的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制作了較為系統(tǒng)的分析及預(yù)測(cè)，為系統(tǒng)開(kāi)發(fā)YCWLD提供科學(xué)依據(jù)及研究方向。

1 材料與方法

1.1 YCWLD化學(xué)成分的收集

從TCMSP（https://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）和Batman-tcm（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）兩個(gè)中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出YCWLD 中六味中藥的化學(xué)成分。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有分子的名稱(chēng)進(jìn)行整理，刪除重復(fù)化合物的化合物，并獲取3D 分子結(jié)構(gòu)*.mol2 格式文件。再借助OpenBabe1 2.4.1 軟件將分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為Smiles 結(jié)構(gòu)序列為后續(xù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)做準(zhǔn)備。其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)收集了《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版本）注冊(cè)500種中藥，通過(guò)文獻(xiàn)研究以及整合了TCM@taiwan，TCMD，TCMID 等10 多個(gè)中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，從而盡可能準(zhǔn)確及全面地獲得每味中藥中的化合物，并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格藥理學(xué)和臨床知識(shí)審查后收錄了30 069 種化合物。此外，該數(shù)據(jù)庫(kù)不僅提供了化合物信息參數(shù)查詢(xún)及化合物結(jié)構(gòu)文件下載功能，而且提供了的另外一個(gè)獨(dú)特的核心功能，即通過(guò)構(gòu)建多個(gè)數(shù)學(xué)模型詳細(xì)地預(yù)測(cè)了各個(gè)化合物的吸收、分布、代謝及排泄（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）等毒藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為化合物地篩選提供了諸多便利，現(xiàn)多應(yīng)用于中藥及復(fù)方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[11]。

1.2 候選化合物的篩選

口服利用度（Oral bioavailability，OB）、類(lèi)藥性（Drug-likeness，DL）兩個(gè)參數(shù)是評(píng)估化合物吸收性后送至循環(huán)系統(tǒng)程度及成藥可能性的重要指標(biāo)，也是評(píng)估口服化合物是否可發(fā)展成為藥物的重要參數(shù)[12-13]。本次研究篩選出符合OB ≥30%、DL ≥0.20 的分子作為候選化合物，其中各個(gè)化合物的OB參數(shù)采用王永華等[14]建立的Obioavail1.1 系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，而類(lèi)藥性借助谷本相似性[15]與drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.drugbank.ca/）中化合物平均分子性質(zhì)進(jìn)行比較而獲得。

1.3 候選化合物的潛在靶標(biāo)的收集

將候選化合物Smiles 分子結(jié)構(gòu)序列導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，物種參數(shù)設(shè)置為Homo sapiens，以置信度閾值（Probability）評(píng)估預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，并選取Probability ≥0.6的靶點(diǎn)作為較可靠的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的靶點(diǎn)取并集從而獲得化合物的潛在靶點(diǎn)。本次使用的Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)是基于分子結(jié)構(gòu)與已有配體進(jìn)行相似性比較，并通過(guò)交叉驗(yàn)證分析從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)[16]。而TCMSP中的靶點(diǎn)主要收集自DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca），但因仍有眾多化合物的靶點(diǎn)待研究，故本次研究采用數(shù)據(jù)庫(kù)收錄結(jié)合預(yù)測(cè)模式來(lái)篩選候選化合物靶點(diǎn)。

1.4 NALFD相關(guān)治療靶點(diǎn)的選擇以及靶點(diǎn)信息查詢(xún)

以“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（TTD）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、CooLGeN 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）查找NALFD 的作用靶點(diǎn)。為減少所選靶點(diǎn)假陽(yáng)性概率，本次研究從三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與疾病相關(guān)度（Relevance score）前100 的靶點(diǎn)作為疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與候選化合物潛在靶點(diǎn)取交集，從而獲得YCWLD 治療NALFD 的靶點(diǎn)。通過(guò)蛋白信息數(shù)據(jù)庫(kù)（universal protein knowledgebase，Uniprot）（www.Uniprot.org）將所有的治療靶標(biāo)名稱(chēng)轉(zhuǎn)換成genesymbol，同時(shí)利用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（www.disgenet.org/）分析潛在治療靶點(diǎn)蛋白類(lèi)型。

1.5 構(gòu)建草藥-候選化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）

采用cytoscape3.7.1 軟件分別構(gòu)建草藥-候選化合物網(wǎng)絡(luò)、候選化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，然后利用軟件中merge 功能模塊將兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并成，從而構(gòu)建草藥-候選化合物-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將治療靶點(diǎn)的gene symbol導(dǎo)入至string（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置物種參數(shù)為人類(lèi)從而獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用cytoscape中的NetworkAnalyzer 功能計(jì)算出各個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)初步評(píng)估其重要性。上述兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)由中藥、化合物、靶點(diǎn)構(gòu)成，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)中的度值（degree）則表示節(jié)點(diǎn)連接其他節(jié)點(diǎn)的數(shù)量，度值越大在網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的樞紐性作用越強(qiáng)，重要性越突出。

1.6 靶點(diǎn)生物功能的注釋分析

通過(guò)生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的治療靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析以及基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，從而探討治療靶點(diǎn)參與的生物學(xué)功能以及靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路，并通過(guò)R3.4.1 軟件可視化以及對(duì)kegg 結(jié)果中重要通路進(jìn)行分析。DAVID 可通過(guò)將輸入的蛋白或基因列表進(jìn)行與已有蛋白或基因生物學(xué)功能注釋相關(guān)聯(lián)，并通過(guò)P值評(píng)估蛋白列表注釋功能的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 YCWLD的候選化學(xué)成分

從TCMSP、Batman-tcm 兩個(gè)數(shù)據(jù)中檢索出YCWLD 化合物分別為439、136 個(gè),刪除重復(fù)值后，篩選出符合OB ≥30%及DL ≥0.20 的候選化合物共57個(gè)，其中茵陳、茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術(shù)分別含有化合物13 個(gè)、16 個(gè)、9 個(gè)、11 個(gè)、7 個(gè)，豬苓與茯苓有相同化合物2 個(gè)，桂枝與茵陳、桂枝與澤瀉、桂枝與豬苓各有1個(gè)相同化合物，各候選化合物信息詳見(jiàn)表1。

2.2 YCWLD治療NALFD的潛在作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中及Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別收集到Y(jié)CWLD 靶點(diǎn)132 個(gè)、186 個(gè)，去掉重復(fù)值后共收集到286 個(gè)靶點(diǎn)。其中茵陳219 個(gè)、白術(shù)31個(gè)、豬苓37個(gè)、茯苓64個(gè)、桂枝86個(gè)，澤瀉33個(gè)。通過(guò)Genecard、CooLGeN、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取1 162靶點(diǎn)，467個(gè)靶點(diǎn)，3個(gè)靶點(diǎn)，合并三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)與疾病關(guān)系度（Relevance score）前100 的靶點(diǎn)，共得到疾病靶點(diǎn)317 個(gè)；將候選化合物潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得34個(gè)YCWLD 治療NALFD 的靶點(diǎn)，各治療靶點(diǎn)詳見(jiàn)表2。

2.3 中藥-候選成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

根據(jù)上述研究結(jié)果，借助cytoscape3.7.1 軟件將6味中藥、57個(gè)候選成分及34個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)并構(gòu)建中藥-候選成分-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。結(jié)果表明，57 個(gè)候選化合物中可作用于治療靶點(diǎn)的有24個(gè)，可初步認(rèn)為YCWLD 中治療NALFD 的有效成分，其他33 個(gè)候選化合物與作用靶點(diǎn)匹配得分較低或暫未發(fā)現(xiàn)有治療NAFLD功能。中藥中茵陳、茯苓、豬苓、白術(shù)、桂枝、澤瀉分別含有有效成分13 個(gè)、6 個(gè)、4 個(gè)、2個(gè)、2 個(gè)、3 個(gè)，作用于32、3、2、5、7、4 個(gè)靶點(diǎn)，可見(jiàn)茵陳對(duì)YCWLD 治療NAFLD 起到了重要作用；化合物中第6 號(hào)化合物（quercetin）、19 號(hào)化合物（beta-sitosterol）、20 號(hào)化合物（sitosterol）連接治療靶點(diǎn)數(shù)目排前三，分別連接28、7、4 個(gè)靶點(diǎn)，可能成為YCWLD 治療NAFLD的主要活性成分。就靶點(diǎn)而言，DPP4、NR1H3、NR1H2、SREBF1、SREBF2 的度值排前五，分別連接13、9、9、3、3 個(gè)化合物，這些靶點(diǎn)可被多個(gè)活性成分刺激是YCWLD 治療NAFLD 主要作用靶點(diǎn)。從圖1可看出，草藥、化合物、靶點(diǎn)之間構(gòu)成了復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，一種化合物對(duì)應(yīng)多種靶點(diǎn)，一種靶點(diǎn)可以受到多種化合物刺激，體現(xiàn)了YCWLD多成分多靶點(diǎn)的治療特點(diǎn)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將34 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入至string 數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置organism：Homo sapeins，節(jié)點(diǎn)之間的置信度（Combine score）設(shè)置為high confidence（0.700）獲取結(jié)果后導(dǎo)入cytoscape 中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見(jiàn)圖2。圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示蛋白之間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中有34 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中2 個(gè)靶點(diǎn)不連接其他蛋白），126 條邊，度值前六的蛋白為IL6、TNF、AKT1、IL1B、CCL2、ICAM1，分別連接19、18、15、14、14、14 個(gè)蛋白，這些蛋白與其他作用靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切，在整個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能成為YCWLD治療NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 治療靶點(diǎn)類(lèi)型分析結(jié)果

從DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)依次檢索各個(gè)作用靶點(diǎn)，獲得蛋白分類(lèi)信息并進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，詳情見(jiàn)圖3，從圖中可知YCWLD 治療NALFD 過(guò)程中以轉(zhuǎn)錄因子、核酸結(jié)合、受體、酶（水解酶、蛋白酶、氧化還原酶、激酶、轉(zhuǎn)移酶等）、信號(hào)分子、酶調(diào)節(jié)劑、鈣結(jié)合蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、載體蛋白等靶點(diǎn)類(lèi)型為主。

表2 治療靶點(diǎn)的基本信息

圖1 草藥-候選化合物-治療靶點(diǎn)網(wǎng)路圖

2.6 GO分析以及KEGG通路富集分析結(jié)果

圖2 治療靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 治療靶點(diǎn)的分類(lèi)信息

本研究中將34 個(gè)治療靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO 富集分析以及KEGG 通路分析，GO 分析從分子功能（Molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）三個(gè)層面分析了各靶點(diǎn)的功能分布。其中BP 分析中符合P＜0.01的條目有137個(gè)，其中富集靶點(diǎn)數(shù)前三的分別為positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、transcription，DNA-templated、inflammatory response，詳見(jiàn)圖4-A；CC分析獲得具有顯著性意義（P＜0.01）的條目6 個(gè)，詳見(jiàn)圖4-B。MF 分析中獲得P＜0.01 的 條 目15 個(gè)，protein binding、transcription factor activity,sequence-specific DNA binding、Acytokine activity、sequence-specific DNA binding 作用突出，詳見(jiàn)圖4-C。KEGG 分析提示作用靶點(diǎn)涉及43 條信號(hào)通路，與NAFLD 可能有關(guān)且P＜0.01 的通路有17 條，其中NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 這三條通路富集靶點(diǎn)數(shù)排前三位，并提示這三條通路可能作為YCWLD 治療NAFLD 的重要通路值得進(jìn)一步探討。此外，圖4-D 結(jié)果顯示，通路分析中免疫、炎癥、及物質(zhì)代謝、凋亡相關(guān)通路同樣富集較多靶點(diǎn)，提示調(diào)節(jié)免疫、抗炎作用、促進(jìn)物質(zhì)代謝、減少干細(xì)胞凋亡可能是YCWLD 治療NALFD 的重要藥效機(jī)制之一。

圖4 GO與KEGG 富集分析結(jié)果

2.7 NAFLD信號(hào)通路分析結(jié)果

根據(jù)KEGG 分析結(jié)果顯示，聚集靶點(diǎn)最多的為NAFLD 通路，通過(guò)R 軟件獲該取通路圖，并用顏色標(biāo)注作用靶點(diǎn)的化合物數(shù)量，如圖5 所示，圖中NAFLD通路通過(guò)TNF 信號(hào)通路、糖尿病信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)等子通路，發(fā)揮改善脂肪性肝炎癥、減少脂肪酸合成、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝細(xì)胞壞死及凋亡的作用。由此可知，非酒精性脂肪肝病的發(fā)病具有多種病因，而YCWLD 通過(guò)多種機(jī)制對(duì)NAFLD 發(fā)揮治療作用。各子通路中胰島素信號(hào)通路因靶點(diǎn)可被多種候選化合物可作用，在YCWLD 治療NAFLD 過(guò)程中占有重要意義，可作為候選子通路進(jìn)一步分析。就草藥而言，茯苓、豬苓、桂枝、茵陳、白術(shù)、澤瀉分別含有4、4、2、2、1、1 個(gè)化合物可作用于NAFLD 通路，茯苓、豬苓含可作用NAFEL 通路單體較多，提示此二種草藥的增減可能對(duì)YCWLD 有效成分配比影響較大，可為臨床或者后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中提供借鑒。

3 討論

YCWLD 對(duì)NALFD 治療效果確切，但其作用機(jī)制尚不明確，目前研究模式多局限于單一靶點(diǎn)或單一生物途徑，難以系統(tǒng)的評(píng)估其作用機(jī)制。應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法可構(gòu)建多種物質(zhì)、多個(gè)層次相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，能系統(tǒng)地闡述分子之間的關(guān)系及復(fù)方整體治療效果。此外，也可對(duì)單個(gè)功能分子進(jìn)行預(yù)測(cè)定位及效果評(píng)估，對(duì)新藥研發(fā)具有指導(dǎo)作用[17]。這種研究方式與中醫(yī)強(qiáng)調(diào)的整體觀及個(gè)體化的辯證施藥理念基本一致。故本研究借助此種方法較為系統(tǒng)地預(yù)測(cè)了YCWLD對(duì)NALFD的作用機(jī)制。

圖5 YCWLD調(diào)控NALFD通路示意圖

中藥及復(fù)方化學(xué)成分多樣，在體內(nèi)的代謝過(guò)程更加復(fù)雜，本次研究將YCWLD 的整體作用量化為多種候選成分的協(xié)同作用，借助TCMSP、batman-tcm 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)較為全面的檢索出了YCWLD 中類(lèi)藥性大且通過(guò)口服吸收入血較佳的56種成分，對(duì)全面預(yù)測(cè)本方作用機(jī)制具有重要意義。然后構(gòu)建了中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以及PPI網(wǎng)絡(luò)，形象直觀的展示出YCWLD調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜的作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提示YCWLD發(fā)揮治療NALFD的作用是通多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。就化合物而言，24個(gè)候選化合物能匹配到治療靶點(diǎn)可能成為YCWLD治療NALFD的有效成分，其中quercetin、beta-sitosterol、sitosterol在化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中可連接多個(gè)治療靶點(diǎn)，提示其潛在作用廣泛具有較好的活性可能是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分。有研究表明quercetin、beta-sitosterol、sitosterol 這三種物質(zhì)均具有減少NAFLD的肝臟中脂質(zhì)積累，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用，除此之外，quercetin還具備改善胰島素抵抗的功能，而Sitosterol 則已被驗(yàn)證可減輕脂肪肝導(dǎo)致的炎癥[18-20]。由此可知網(wǎng)絡(luò)中值較高的化合物治療NAFLD的作用與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，提示網(wǎng)絡(luò)中候選成分具有一定的可靠性，可為進(jìn)一步研究YCWLD治療NALFD的藥效物質(zhì)提供新的思路及方向。

本研究中候選化合物的靶點(diǎn)，采用預(yù)測(cè)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索兩種方式獲得，并與TTD、CooLGeN、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中的NALFD 靶點(diǎn)進(jìn)行交叉映射，最終獲得YCWLD 治療NALFD 的34 個(gè)靶點(diǎn)。PPI網(wǎng)絡(luò)表明這些靶蛋白之間非單獨(dú)產(chǎn)生作用而是存在復(fù)雜交錯(cuò)的相互作關(guān)系；而靶點(diǎn)分類(lèi)結(jié)果則顯示靶蛋白由轉(zhuǎn)錄因子、核酸結(jié)合、受體、酶、信號(hào)分子、酶調(diào)節(jié)因子等多種類(lèi)型組成。多類(lèi)型靶點(diǎn)相互協(xié)調(diào)及靶點(diǎn)間的連通性與中醫(yī)的“同病異治”的理念相似，也可能是YCWLD治療NALFD 療效加強(qiáng)的機(jī)制之一。就靶點(diǎn)而言，中藥-候選化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點(diǎn)意味著可能被多種候選化合物刺激而產(chǎn)生作用，PPI 網(wǎng)絡(luò)中的高度值的靶點(diǎn)則代表具有更好的連通性對(duì)整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要[21]，因此兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的高度值靶點(diǎn)可能在YCWLD 治療NALFD 過(guò)程中發(fā)揮著核心的作用，值得研究人員重點(diǎn)關(guān)注。就候選化合-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)而言，DPP4 度值最高，已被證明與胰島素抵抗、NAFLD 以及肝硬化的發(fā)生率密切相關(guān)[22-23]，經(jīng)典DPP4 抑制劑如阿格列汀除了可調(diào)節(jié)血糖改善代謝紊亂外，還可緩解肝臟脂肪變性、保護(hù)肝功能、抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）激活、有助于肝纖維化的緩解[24]。而另外兩種高度值靶點(diǎn)肝X 受體α（LXRα，NR1H3）和肝X 受體β（LXRβ，NR1H3）均屬于II 類(lèi)核受體的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)調(diào)控SREBP1 來(lái)影響脂質(zhì)合成[25]，同時(shí)也可以驅(qū)動(dòng)參與肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的基因表達(dá)，是預(yù)防和治療非酒精性脂肪性肝病的重要靶點(diǎn)[26]。有研究進(jìn)一步表明，當(dāng)脂肪肝發(fā)展到到更具破壞性的炎癥和纖維化階段，NR1H3 也是新型抗炎或抗纖維化的靶標(biāo)之一[27-28]。此外，靶點(diǎn)中PPARs 的三個(gè)亞型PPARA、PPARD、PPARG 雖連接化合物較少，但均已被證明在減少肝臟脂質(zhì)積聚、緩解炎癥反應(yīng)、改善解胰島素抵抗等方面具有重要調(diào)節(jié)的作用，目前已有多種藥物應(yīng)用于臨床[29-31]。PPI 網(wǎng)絡(luò)中其樞紐作用較強(qiáng)的靶點(diǎn)與免疫及炎癥密切相關(guān)，其中炎癥是非酒精性脂肪性肝炎的突出標(biāo)志，肝細(xì)胞中的炎癥導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞凋亡的增加，可被視為NAFLD進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)力[32]。免疫細(xì)胞的激活同樣會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致組織損傷為晚期纖維化和肝硬化奠定基礎(chǔ)[33]。因此，探索炎癥和免疫相關(guān)靶點(diǎn)可以提高對(duì)NAFLD 潛在機(jī)制的理解，并有助于新療法的開(kāi)發(fā)。上述研究結(jié)果表明，本次研究預(yù)測(cè)的多個(gè)核心靶點(diǎn)已被證明具有調(diào)控NAFLD 的作用，網(wǎng)絡(luò)中其余高度值靶點(diǎn)具有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

NAFLD 是一種復(fù)雜疾病，脂類(lèi)聚集、炎癥是其發(fā)病及進(jìn)展的兩個(gè)重要步驟，也是“二次打擊”學(xué)說(shuō)的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，因此減少肝臟脂肪積累及減輕炎癥是治療NAFLD的關(guān)鍵。本研究中功能富集分析結(jié)果顯示，NAFLD 的治療靶點(diǎn)主要參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯及炎癥等生物學(xué)過(guò)程。這些過(guò)程具有改善代謝，促進(jìn)組織修復(fù)及減輕炎癥反應(yīng)的作用，可從多個(gè)方面參與NAFLD病變組織的修復(fù)過(guò)程，與NAFLD發(fā)病機(jī)制相吻合?；贙EGG 通路分析顯示NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 富集治療靶點(diǎn)數(shù)較多，提示這三條通路是YCWLD 治療NAFLD 過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中NAFLD 通路是以疾病直接命名的通路且涵蓋了TNF、insulin 等多條子通路，體現(xiàn)了NAFLD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，也揭示了單一的藥物難以達(dá)到理想的治療效果的可能原因。相較而言，YCWLD 在多個(gè)子通路中均有治療靶點(diǎn)，提示此復(fù)方多機(jī)制調(diào)控的優(yōu)越性且具有巨大潛在研究?jī)r(jià)值；其余兩條通路也與有NAFLD 發(fā)病以及進(jìn)展密切相關(guān)，其中Cytokinecytokine receptor interaction 與慢性炎癥密切相關(guān)，而Insulin resistance 則可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中脂解作用受損以及機(jī)體過(guò)多的向肝臟輸送游離脂肪酸從而造成肝臟脂肪的積累[34]。由此推測(cè)YCWLD 可通過(guò)調(diào)控此二條通路可減少NAFLD“二次打擊”的形成。此外通路分析結(jié)果中Mark、Toll-like receptor、NOD、HIF-1 也均已被證明與NAFLD 密切相關(guān)[35-38]，且均富集有較多YCWLD 的治療靶點(diǎn)，提示YCWLD 可能通過(guò)調(diào)控這些通路進(jìn)而干預(yù)NAFLD炎癥和免疫、代謝穩(wěn)態(tài)、脂毒性、肝細(xì)胞死亡等發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制。

綜上所述，本次研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建了中藥-候選化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，其中包含6 味中藥、24個(gè)候選成分及34個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)quercetin、beta-sitosterol、sitosterol 可 能 是YCWLD發(fā)揮抗NAFLD 作用的關(guān)鍵成分，DPP4、NR1H3、NR1H2、SREBF1、SREBF2 在眾多靶點(diǎn)中作用較為突出。調(diào)控NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 等潛在信號(hào)通路從而干預(yù)炎癥和免疫、代謝穩(wěn)態(tài)、脂毒性、肝細(xì)胞死亡等機(jī)制可能是YCWLD發(fā)揮預(yù)防及治療NAFLD的作用的關(guān)鍵。本研究系統(tǒng)的預(yù)測(cè)及分析了TCWLD 治療NAFLD 的機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究YCWLD 抗NAFLD 的關(guān)鍵化合物、靶點(diǎn)、通路提供了方向。然而，本次研究?jī)H以各節(jié)點(diǎn)關(guān)系的數(shù)量評(píng)估其重要性而并未顧及關(guān)系的強(qiáng)度，故此次預(yù)測(cè)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)有一定的偏差。同時(shí)在評(píng)估YCWLD 的整體作用時(shí)，僅考慮各中藥中單體疊加作用，未考慮草藥劑量、煎煮過(guò)程各候選化合物的化學(xué)反應(yīng)、以及候選化合是否存在相互干擾吸收等問(wèn)題，因此本次研究結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。