周文靜，張 萌，周榮榮，趙 樂，李志勇，2，王永輝，李艷彥＊＊

（1. 山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 晉中 030619；2. 中央民族大學藥學院 北京 100081）

角藥是基于辨證論治原則與中藥藥性理論，由三味具有相互促進或相反相成作用的中藥聯(lián)合配伍而成[1]。角藥作為中藥方劑具體配伍形式，在擴大藥物使用范圍、協(xié)同增效、減毒增效等方面發(fā)揮著重要的作用[2]。

黃芪，甘、微溫，歸脾、肺經，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒斂瘡、利水消腫等功效，素有“補氣圣藥”之稱[3]。當歸，味甘、辛，性溫，歸肝、脾經，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功效，為“補血要藥”[4]。黃芪與當歸配伍構成經典名方當歸補血湯，李東垣在《內外傷辨惑論》卷中提出凡屬血虛氣弱者，均可以當歸補血湯加減應用[5]。為增強其補氣養(yǎng)血效果，加入平補氣血之大棗。大棗，始載于《神農本草經》，列為上品，具有補中益氣，養(yǎng)血安神之功，是少有的具有補氣養(yǎng)血兩者功效的單味中藥[6]。黃芪、當歸配伍大棗，大棗既可增強黃芪補氣之功，又能增加當歸養(yǎng)血之效，構成補氣養(yǎng)血的角藥。同時，黃芪是2018 年國家衛(wèi)健委新增的藥食同源藥，當歸除藥用外，可用于藥膳當中或作為天然調味香料使用，大棗是常用的藥食同源藥材，歷史悠久。因此，“黃芪-當歸-大棗”角藥一方面可作為治療氣血兩虛證的常用藥物組合，另一方面可作為開發(fā)相關功能食品的原料，應用范圍廣泛。

雖然“黃芪-當歸-大棗”角藥補氣養(yǎng)血的作用明確，但是從分子層面上系統(tǒng)的分析其藥效物質基礎和作用機制，尚未見相關論述和報道。近年來，興起的網(wǎng)絡藥理學方法，其整體性、系統(tǒng)性的研究特點與中藥多成分、多靶點和多途徑的作用特點相吻合[7]，適合探究復方中藥的藥效物質基礎及作用機制，被廣泛應用。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，從分子層面預測“黃芪-當歸-大棗”角藥補氣養(yǎng)血的物質基礎與分子機制，并通過動物實驗驗證預測的可靠性，以期為進一步臨床應用提供理論指導，為藥食同源藥物研究提供方法思路。

1 材料與方法

1.1 化學成分收集

采用中藥系統(tǒng)藥理學分析（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB） ≥ 30%、類 藥 性（Druglikeness，DL）≥0.18為前提篩選黃芪、當歸和大棗的化學成分。

1.2 作用靶點預測

進一步在TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行作用靶點預測，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點蛋白進行名稱標準化，統(tǒng)一轉換成人源（Homo sapiens）基因靶點名稱，剔除重復項。

1.3 蛋白互作PPI網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選

將以上收集的“中藥-成分-靶點”數(shù)據(jù)庫，輸入Cytoscape 3.2.1 軟件，利用Network Analyzer 插件進行網(wǎng)絡拓撲分析，按度值degree 值取其中位數(shù)。將篩選的靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），獲得靶點蛋白互作PPI 網(wǎng)絡，保存為TSV 格式，導入Cytoscape 3.2.1軟件，根據(jù)degree 值的大小篩選出核心靶點，進行可視化展示，進一步獲得關鍵靶點。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）將篩選的核心靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。設置參數(shù)P＜0.05，考察“黃芪-當歸-大棗”角藥作用靶點的生物過程、分子功能和細胞組分及生物學通路，并根據(jù)富集程度和P值，將排名前20 位利用Graph Pad Prism 5 繪圖。使用Cytoscape 3.2.1 軟件構建“中藥-成分-靶點-通路”完整網(wǎng)絡。通過KEGG（https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫KEGG mapping 獲取相關通路圖。

1.5 實驗驗證

1.5.1 造模與給藥

選取SPF 級KM 小鼠30 只（購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，批號：SCXK（京）2016-0011），7周齡左右，體重18±4 g，雌雄各半，分為正常組、模型組和治療組。除正常組外其余各組在第1 d 與4 d 按照0.2 mg·kg-1皮下注射2%乙酰苯肼（上海易恩化學技術有限公司，批號：R017768），按照0.3 mg·kg-1每天一次腹腔注射1%環(huán)磷酰胺（上海易恩化學技術有限公司，批號：R014054），正常組在同時間點僅腹腔注射等體積生理鹽水。同時，除正常組每天給予飼料外，其余各組在第1 d 飽食后禁食兩天，第4 d 再給飼料，以構建氣血兩虛小鼠模型[8-10]。第五天開始治療組灌以“黃芪-當歸-大棗”角藥，按照當歸補血湯黃芪與當歸比例為5∶1，并結合前期預實驗結果，選取黃芪10 g，當歸2 g，大棗8 g 水煎劑，濃度為2.5 g·mL-1，按照0.02 ml·g-1一日一次灌胃，連續(xù)六天，正常組與模型組灌以相應劑量的蒸餾水。觀察小鼠的一般狀態(tài)，小鼠末次給藥后，禁食，取全血抗凝備用。

1.5.2 小鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)測定

末次給藥后，稱取小鼠體重并做好記錄，頸椎脫臼處死小鼠后，取整個胸腺和脾臟，用生理鹽水沖洗，濾紙瀝干，電子天平稱重，計算胸腺和脾臟指數(shù)。計算公式：胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺（脾臟）重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.5.3 外周血象檢測

采用血液分析儀檢測各組小鼠外周血紅細胞（Red blood cell，RBC）、血紅蛋白（Haemoglobin，HGB）的數(shù)量。

1.5.4 Real-time PCR檢測PTGS2mRNA表達

前列腺素合成酶2（PTGS2）mRNA 檢測，按照Trizol 試劑（北京聚合美生物科技有限公司，批號MF11501）提取總RNA，反轉錄為cDNA。Real-time PCR 采用Light Cycler?480 II 系統(tǒng)，步驟為：變性95 ℃，15 s；退火56 ℃，30 s；延伸72 ℃，20 s；共擴增44個循環(huán)。引物序列為：PTGS2 上游5'-TGAGCAAC?TATTCCAAACCAGC-3'，下游5'-GCACGTAGTCTTC?GATCACTATC-3'，擴增片段長度為74 bp；GAPDH 上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下 游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'，擴增片段長度為123 bp。結果處理用ΔΔCT 法：A = CT（目的基因，待測樣本）-CT（內標基因，待測樣本）；B = CT（目的基因，對照樣本）-CT（內標基因，對照樣本），K=A-B，表達倍數(shù)=2-K來計算mRNA的相對表達量。分析得出各個樣 品量 的 循環(huán) 閾值（Ct），用2-ΔΔCt公式 計算PTGS2mRNA的相對表達量。

1.5.5 ELISA法檢測TNF-α的含量

取各組的肝素抗凝血漿嚴格按照ELISA 試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司，批號MF821）操作步驟，測定血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

利用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 化學成分收集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，篩選得到黃芪87 個、當歸69個和大棗133 個化學成分，進一步按照OB，DL 參數(shù)篩選得黃芪20個，主要為黃芪多糖類、皂苷類、黃酮類及醇類等；當歸5 個，主要為揮發(fā)油類、多糖類、甾體類等；大棗25個，主要為皂苷類、生物堿類、甾體類、黃酮類等化合物，獲得“黃芪-當歸-大棗”角藥化學成分47個，其中共有成分3個，見表1。

2.2 作用靶點預測

為了揭示“黃芪-當歸-大棗”防治氣血兩虛證的分子機制，預測作用靶點黃芪206 個、當歸53 個、大棗204 個，中藥兩兩之間均具有不同數(shù)量的共同靶點，說明其之間存在某些相互協(xié)同的作用關系（見圖1），進一步分析三藥共有靶點有43 個，分別為TGFB1、

SLC6A4、SLC6A3、SLC6A2、SCN5A、RXRA、PTGS2、PTGS1、PLAU、PIK3CG、PDE3A、PGR、OPRM1、NCOA2、FOS、KCNH2、JUN、AKT1、HTR2A、GABRA5、GABRA3、GABRA2、GABRA1、EGFR、EGF、CXCL8、ESR1、DRD1、CHRM4、CHRM2、CHRM1、CASP9、CASP8、CASP3、BCL2、BAX、AKR1B1、ADRB2、ADRB1、ADRA1B、ADH1C、IL6 和ERBB2。黃芪、當歸、大棗雖然單味藥作用廣泛，但配伍組合后為補氣養(yǎng)血重要組合，由此推測“黃芪-當歸-大棗”角藥可能通過這些共有靶點發(fā)揮補氣養(yǎng)血的協(xié)同作用。

2.3 蛋白互作PPI網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選

圖1 黃芪、當歸、大棗共有靶點韋恩圖

根據(jù)網(wǎng)絡拓撲degree 值由大到小排列，按中位數(shù)取221 個“黃芪-當歸-大棗”角藥作用靶點，輸入STRING 數(shù)據(jù)庫構建靶點蛋白互作PPI 網(wǎng)絡，選degree值前100位的靶點為核心靶點，并進行可視化展示（見圖2），圖中越接近紅色表明網(wǎng)絡中節(jié)點越大，即degree值 越 大。 排 名 前10 位 的 包 括：AKT1（RACalphaserine/threonine-proteinkinase，RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、IL6(Interleukin-6，白細胞介素-6)、FOS（Proto-oncogenec-Fos，原 癌 基 因c-Fos）、ESR1（Estrogen receptor1，雌 激 素 受 體 1）、PTGS2（Prostaglandin G/H synthase 2，前列腺素G/H 合成酶2）、EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生長因子受體）、EGF（Pro-epidermal growth factor，表皮生長因子）、CASP3（Caspase-3，半胱天冬蛋白酶3）、JUN（Jun proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit，

Jun 原癌基因/AP-1 轉錄因子亞單位）、ERBB2（Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2，紅細胞白血病病毒癌基因同源物2）。可以發(fā)現(xiàn)這10 個靶點均為三藥共有靶點，可能是角藥發(fā)揮補氣養(yǎng)血作用的關鍵靶點，且網(wǎng)絡中節(jié)點與節(jié)點相互相連，說明靶點之間的關系密切，存在相互協(xié)同的作用。

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析

對篩選的核心靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)“黃芪-當歸-大棗”角藥主要定位在內質網(wǎng)膜、線粒體、胞液；參與免疫應答，神經元凋亡過程負調控、血管收縮正向調節(jié)、炎癥反應等生物過程；并結合轉錄因子、血紅素、細胞因子、生長因子、過氧化物酶、α-腎上腺素能受體等分子功能發(fā)揮補氣養(yǎng)血作用，主要涉及癌癥（胰腺癌、結直腸癌、前列腺癌、非小細胞肺癌）信號通路，TNF、P53、Foxo、HIF-1 信號通路，鈣信號通路以及感染性疾病信號通路等，見圖3。

表1 “黃芪-當歸-大棗”角藥部分化學成分的基本信息

圖2 關鍵靶點網(wǎng)絡

圖3 GO功能和KEGG通路富集分析

圖4 “中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡

圖5 TNF信號通路

為了更好的解釋化學成分與相應靶點以及對應信號通路之間復雜的作用關系，將KEGG 通路富集分析前20 位結果繪制“中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡（見圖4），可以發(fā)現(xiàn)“黃芪-當歸-大棗”角藥多種藥物化學成分對應多種作用靶點，多種靶點又映射于不同通路，體現(xiàn)其多成分、多靶點、多通路和整合調節(jié)的復雜網(wǎng)絡特點。進一步以TNF 信號通路為例，從KEGG mapping 獲取TNF 信號通路圖（見圖5），紅色部分為“黃芪-當歸-大棗”角藥的作用靶點，得到有15個靶點通過調節(jié)其中多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。

2.5 實驗驗證

實驗期間，正常組小鼠毛色柔順光亮，活動靈活，爪子、耳朵呈正常淡紅色，攝食、飲水量正常。模型組小鼠毛發(fā)易脫落，缺少光澤，活動減少、扎堆、倦臥，爪子、耳色顏色偏淡，飲水、攝食量減少。治療組小鼠精神好轉，毛發(fā)恢復柔順，耳色，爪子顏色恢復淡紅色，攝食、飲水量逐漸趨于正常。同時，與正常組比較，模型組小鼠的體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，治療組小鼠的體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與空白組比較，模型組RBC、HGB 數(shù)量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，治療組RBC、HGB 數(shù)量明顯升高（P＜0.01）（見表2）。這表明氣血兩虛證模型小鼠造模成功，且“黃芪-當歸-大棗”角藥對氣血兩虛小鼠有一定治療作用。

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、RBC、HGB檢測結果（± s，n = 10）

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、RBC、HGB檢測結果（± s，n = 10）

注：與正常組比較*P ＜0.01；與模型組比較▲P ＜0.01

HGB/(g·L-1)161.08±6.99 96.22±5.67*137.56±5.86▲組別正常組模型組治療組體重/g 32.17±2.30 22.31±2.47*29.00±2.01▲胸腺指數(shù)/(mg·g-1)2.32±0.23 0.85±0.15*1.92±0.30▲脾臟指數(shù)/(mg·g-1)3.84±0.84 2.30±0.05*3.28±0.92▲RBC/(1012·L-1)9.26±0.42 4.20±0.27*8.21±0.16▲

表3 各組PTGS2、TNF-α檢測結果(± s，n = 10）

表3 各組PTGS2、TNF-α檢測結果(± s，n = 10）

注：與正常組比較*P ＜0.01；與模型組比較▲P ＜0.01

TNF-α/(ng·L-1)37.68±4.02 64.58±5.05*40.52±4.89▲組別正常組模型組治療組PTGS2/(2-ΔΔCT)1.21±0.45 6.03±0.67*2.56±0.76▲

進一步從TNF 信號通路進行實驗驗證，PTGS2 是“黃芪-當歸-大棗”角藥的作用于此通路預測的一個關鍵靶點，且未見氣血兩虛證中PTGS2 在TNF 通路中表達情況的相關報道，本研究選取PTGS2 進行進一步實驗。實驗結果顯示，與空白組比較，模型組PTGS2mRNA 表達水平與TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組PTGS2mRNA 表達水平，TNF-α含量明顯降低（P＜0.01）（見表3）。表明“黃芪-當歸-大棗”角藥可能通過調控PTGS2mRNA 表達，降低TNF-α釋放，進而抑制TNF 信號通路的激活，發(fā)揮對氣血兩虛小鼠的治療作用，進一步證實了網(wǎng)絡藥理學預測的可靠性。

3 討論

氣血兩虛證屬于中醫(yī)證候，是指由于素體脾胃虛弱，或飲食不節(jié)，或久病大病失養(yǎng)，亦或因產時產后，導致氣血兩虛，表現(xiàn)為面色萎黃或淡白，頭暈目眩，少氣懶言，神乏力，或有自汗，心悸失眠，舌質淡嫩，脈細弱等[11]。氣血兩虛證可見于癌癥、手術后、貧血、產后腹痛等多種疾病?！包S芪-當歸-大棗”角藥作為補氣養(yǎng)血的重要組合，既可藥用，對于輕度氣血兩虛者又可食療，作用廣泛。

網(wǎng)絡藥理學分析得到“黃芪-當歸-大棗”角藥化合物47 個，共有成分為槲皮素（Quercetin）、丁子香萜（Mairin）和豆甾醇（Stigmasterol），預測得到共有靶點43 個。三藥之間存在共同成分、共同靶標，說明合用可起到協(xié)同增效的作用，充分體現(xiàn)多成分，多靶點的協(xié)同作用特點。

進一步分析，得到“黃芪-當歸-大棗”角藥補氣養(yǎng)血 關 鍵 靶 點10 個，包 括AKT1、IL6、FOS、ESR1、PTGS2、EGFR、EGF、CASP3、JUN 和ERBB2。AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與腫瘤、心血管、神經系統(tǒng)等疾病發(fā)生相關[12]。FOS 與JUN 家族的蛋白以同源或異源二聚體的形式結合形成AP-1，進而調控細胞生長、分裂、增殖等活動，原癌基因蛋白c-fos 和c-Jun在多種惡性腫瘤中呈高表達[13]。ESR1（雌激素受體1）是雌激素及選擇性雌激素受體調節(jié)生物學效應的主要介導者，參與乳腺癌、子宮內膜癌和骨質疏松癥等疾病的病理過程[14]。EGF 是一種多肽類生長因子[15]，EGFR 為原癌基因C-erbB 表達產物，與EGF 特異性結合后，可以促進細胞分裂和增殖，形成機體上皮組織增生[16]，在許多實體腫瘤中存在EGFR 與EGF 的高表達或異常表達。已有研究報道，氣血兩虛型胃癌癌前病變存在EGFR 高表達[17]，氣血兩虛型胃癌血清中EGF 明顯升高[18]。而ERBB2 為EGF 受體家族成員之一[19]，研究發(fā)現(xiàn)，C-erBb-2 蛋白的陽性率在胃癌不同中醫(yī)證型之間存在差異，其中氣血兩虛型陽性率達63.2%[20]。CASP3 是細胞凋亡的主要執(zhí)行者。PTGS2為前列腺素內源性過氧化物合酶，參與炎癥和有絲分裂形成的前列腺樣生物合成[21]。多功能細胞因子IL-6，在免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用[22]?？梢园l(fā)現(xiàn)，這些靶點主要為一些轉錄因子、細胞因子、生長因子和過氧化物酶等，在免疫炎癥反應、細胞凋亡等方面發(fā)揮作用，疾病方面主要富集于癌癥。氣血兩虛證是癌癥常見的證型，中醫(yī)認為“正氣存內，邪不可干”，惡性腫瘤的發(fā)病有多種因素，總體來說是因虛發(fā)病，其中以氣虛質發(fā)病最高[23]，而氣虛常伴隨血虛，形成氣血兩虛證?！靶爸鶞悾錃獗靥摗?，腫瘤放療或化療等術后亦會出現(xiàn)氣血兩虛證[24]。推測“黃芪-當歸-大棗”角藥一定程度可作為防治癌癥的藥物組合或食療方。

KEGG 通路富集分析結果顯示，“黃芪-當歸-大棗”角藥主要介導癌癥信號通路，TNF、P53、Foxo、HIF-1 信號通路，鈣信號通路等發(fā)揮補氣養(yǎng)血的作用。選取KEGG 通路排名前20 位構建“中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖，可以發(fā)現(xiàn)“黃芪-當歸-大棗”角藥作用多靶點映射于不同通路。本研究以TNF 信號通路為例，選取“黃芪-當歸-大棗”角藥作用于此通路的關鍵靶點PTGS2 進行實驗驗證。PTGS2 是前列腺素合成起始步驟的關鍵酶，其負責催化產生PGE2 等炎癥介質，從而擴張血管、提高血管通透性，促進炎癥反應。TNF-α是一類具有多種生物效應的細胞因子，其通過和細胞膜上特異性受體結合，實現(xiàn)促進細胞生長，分化，調亡及誘發(fā)炎癥等生物學效應。TNF-α屬于TNF家族，可以激活TNF 信號通路，實現(xiàn)其細胞毒性，炎性反應，免疫調節(jié)和細胞凋亡等生物學功能[25]。通過建立氣血兩虛小鼠模型，治療組灌胃以“黃芪-當歸-大棗”角藥水煎劑，結果顯示：模型組小鼠PTGS2mRNA表達、TNF-α含量明顯升高（P＜0.01），治療組PTGS2mRNA表達、TNF-α含量明顯降低（P＜0.01），說明“黃芪-當歸-大棗”角藥可能通過降低PTGS2mRNA 表達，減少TNF-α的釋放，進而抑制TNF 信號通路的激活而發(fā)揮補氣養(yǎng)血的作用。進一步證實了，網(wǎng)絡藥理學預測得到的“黃芪-當歸-大棗”角藥補氣養(yǎng)血可能的分子機制，確保方法和所得結論的可靠性。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法探討“黃芪-當歸-大棗”角藥補氣養(yǎng)血作用的化學成分、作用靶點、生物過程和信號通路，形成“中藥-成分-靶點-通路”的完整作用過程，并加以實驗驗證。體現(xiàn)了“黃芪-當歸-大棗”通過多成分、多靶點和多通路發(fā)揮治療作用的特點，為其進一步臨床應用提供理論指導，為藥食同源藥物研究提供方法思路。