蔡彩榮，曾 婷，袁素梅，張小坡，譚銀豐＊＊

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 海口 571199；2. 海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室 ?？?571159）

肥胖和超重已經(jīng)成為發(fā)達國家和部分發(fā)展中國家的重要健康問題。世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，2016年，全球18 歲及以上的成年人中逾19 億人超重，其中超過6.5億人肥胖，超過3.4億名5-19歲兒童和青少年超重或肥胖[1]。與體重正常的人相比，肥胖者更易罹患高血脂、高血糖、高血壓等病癥。一方面人們應(yīng)該加強運動健康飲食，另一方面具有減肥降脂作用的保健食品也為市場所需。

野菠蘿是露兜樹屬植物露兜簕（Pandanus tectorius(L).Parkins）的果實。因形狀類似菠蘿，嶺南民間習稱野菠蘿。野菠蘿在海南分布廣泛，資源豐富，民間可作為野果食用，果肉甜味，但果肉中富含維管組織，口感較差，因此不太受歡迎，在海南民間用于痢疾、咳嗽的治療。露兜簕的根、葉等部位可作藥用，具有清熱祛濕、利尿解表、行氣平肝等功效[2,3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，野菠蘿有效成分可以調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝，減少體內(nèi)脂肪堆積，改善胰島素抵抗[4,5]。野菠蘿有長期作為野果食用的歷史，目前尚未見食用后產(chǎn)生毒副作用的報道，安全性較高，非常有利于開發(fā)減肥保健食品。

1 材料

1.1 藥品、試劑與儀器

野菠蘿，采集自海南省海口市東部沿海地區(qū)，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室田建平教授鑒定為露兜樹屬植物露兜簕（Pandanus tectorius(L).Parkins）的果實。膽固醇測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；甘油三酯測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；葡萄糖測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);低密度脂蛋白膽固醇（LDL）測試盒（南京建成生物工程研究所）；高密度脂蛋白膽固醇（HDL）測試盒（南京建成生物工程研究所）；美谷分子儀器（上海）有限公司；日本久保田KUBOTA 5922型低溫離心機。

1.2 實驗動物與飼料

SPF 級7 周齡16-20 g 雄性C57BL/6 雄性小鼠70只，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：No.43006700017619，許可證號：SCK（湘）2014-0011。TP23300型60%高脂高糖飼料（含蛋白質(zhì)19.4%、碳水化合物20.6、脂肪60%、熱量5.1 千卡/g）和對照飼料（含蛋白質(zhì)19.4%、碳水化合物70.6、脂肪10%、熱量3.6 千卡/g），由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。

2 方法

2.1 野菠蘿提取物的制備

取野菠蘿干果，水洗凈，每千克加入3 升水，浸泡過夜。加熱至沸騰后提取1.5 h，過濾收集提取液，同法再加水提取一次，合并兩次提取液，加熱濃縮至流浸膏狀，得野菠蘿提取物（YBL）。提取物得率為3.24%。

2.2 動物分組與實驗方案

參考文獻報道[6]與國食藥監(jiān)?；痆2012]107號中《減肥功能評價方法》確立的保健食品減肥功效的評價方法[7]設(shè)計野菠蘿提取物減肥作用動物實驗研究方案。

選用無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級7 周齡16-20 g 雄性C57BL/6 雄性小鼠70 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 天后，取60 只小鼠喂食TP23300 型高脂高糖肥胖模型飼料誘導(dǎo)肥胖模型，另10只作為空白對照組喂食TP23302 型對照飼料。肥胖模型飼料喂養(yǎng)第4 周（第24 天），60 只小鼠按體重增重排序，淘汰體重增重較低的1/3肥胖抵抗小鼠。將篩選出的40只肥胖敏感小鼠隨機分為4 組：模型組、YBL 高劑量組、YBL 中劑量組、YBL 低劑量組，繼續(xù)喂食肥胖模型飼料，空白對照組繼續(xù)給予低脂低糖對照飼料。所有小鼠均單籠飼養(yǎng)。肥胖模型飼料喂養(yǎng)第5 周（第30 天），將YBL 溶解于純凈水中使?jié)舛确謩e為2.4 mg/mL、1.2 mg/mL、0.6 mg/mL，給予YBL高、中、低劑量組動物飲用。每周記錄各組動物給食量、撒食量、剩食量，記錄飲水量、體重變化。根據(jù)飲水量測量結(jié)果，每30 g 體重的小鼠每日飲用量為5.0±0.8 mL，則各組小鼠每日給藥YBL提取物劑量分別約為400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg。

肥胖模型飼料喂養(yǎng)第13 周（給藥YBL 干預(yù)第54天），以第13 周體重減去第1 周體重計算各組小鼠增重。所有小鼠禁食12 h 后，異氟烷麻醉，經(jīng)眼眶靜脈叢采血，4000 rpm 離心分取血清，-80℃保存待測。脫頸椎處死小鼠，剖開腹部，拍照記錄腹部脂肪堆積情況，取腎周圍脂肪、睪丸周圍脂肪，并稱重，計算脂/體比。取肝組織一部分放入4%多聚甲醛中保存，制備病理切片，HE染色后觀察病理變化。

2.3 數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計方法

實驗計量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差（± s）表示，采用SPSS17.0 軟件分析，經(jīng)正態(tài)分布與方差齊性檢驗后，多樣本均數(shù)比較采用方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）分析，多組間兩兩差異采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 野菠蘿提取物對肥胖模型小鼠體重、食量、脂/體比、增重的影響

高脂高糖肥胖模型飼料喂養(yǎng)4周后的小鼠與對照飼料喂養(yǎng)的正常小鼠體重明顯增加（p＜0.05），此后體重差異越來越大，脂肪/體重比值顯著升高。第13 周實驗結(jié)束時，日常飲用野菠蘿提取物（YBL）溶液（濃度2.4 mg/mL，1.2 mg/mL）的干預(yù)組小鼠比肥胖模型組小鼠體重和增重更?。╬＜0.05-0.01），脂肪/體重比值更低（p＜0.05）。實驗期間各組小鼠每日消耗的飼料量并無顯著差異。詳細結(jié)果見圖1。

以上結(jié)果表明，野菠蘿提取物干預(yù)后可以有效控制肥胖小鼠的體重增加趨勢，降低體內(nèi)脂肪比例。

3.2 野菠蘿提取物對肥胖模型小鼠血清脂質(zhì)、葡萄糖水平的影響

高脂高糖肥胖模型飼料喂養(yǎng)13 周后的小鼠與對照飼料喂養(yǎng)的正常小鼠血清膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等脂質(zhì)水平顯著增加（p＜0.05-0.01），血清葡萄糖（Glu）含量顯著增高（p＜0.01）。日常飲用野菠蘿提取物（YBL）溶液（濃度2.4 mg/mL，1.2 mg/mL）的干預(yù)組小鼠比肥胖模型組小鼠血清CHO、LDL、Glu 水平更低（p＜0.05-0.01），HDL 水平更高（p＜0.05～0.01）。對血清中TG水平無顯著影響。結(jié)果詳見表1。

圖1 YBL對肥胖模型小鼠的影響

表1 野菠蘿提取物(YBL)對肥胖模型小鼠血清脂質(zhì)、葡萄糖水平的影響

結(jié)果表明，野菠蘿提取物干預(yù)后可以有效控制肥胖小鼠血脂CHO、LDL、Glu水平，可以升高HDL水平。

3.3 野菠蘿提取物對肥胖模型小鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

肝臟組織切片HE 染色顯微鏡下觀察可見肥胖模型小鼠肝組織脂肪堆積顯著，細胞形態(tài)變大，呈周邊型脂肪變。YBL 給藥組小鼠不同程度的減輕了肝臟的脂肪性病變。結(jié)果詳見下圖2。

4 討論

研究表明，野菠蘿果實中富含有機酸[8]、黃酮[9]、萜類[10]、木脂素類成分[11]，其中一些化學(xué)成分有很好的藥理活性，比如抗氧化、抗炎、抗病毒等[12]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，野菠蘿提取物富含咖啡酰奎寧酸部位具有顯著的降低高脂血癥金黃地鼠血清和肝臟血脂，調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用。野菠蘿咖啡?？鼘幩峄衔锟梢燥@著提高脂質(zhì)過氧化物酶體增殖劑激活受體α亞型（Peroxisome proliferators-activated receptorsαhypotype，

PPARα）等相關(guān)基因的表達水平, 同時顯著抑制膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）等脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達水平。表明野菠蘿可能主要通過調(diào)節(jié)PPARα通路，促進甘油三酯水解和脂肪酸分解產(chǎn)生降血脂脂作用[13,14]。

圖2 YBL對肥胖模型小鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

本研究觀察到野菠蘿經(jīng)簡單的水煎煮提取后提取物即有降血脂減肥作用。野菠蘿提取物并不減少高脂高糖飼料喂養(yǎng)小鼠的攝食量，說明其減肥、降脂作用不是通過減少食量產(chǎn)生的。同時，本研究中野菠蘿提取物與之前發(fā)現(xiàn)的富含咖啡?？鼘幩岵课欢伎梢越档头逝帜Ｐ蛣游锏难剑珜Σ煌N類的血脂影響不完全一致。野菠蘿富含咖啡?？鼘幩岵课伙@著降低高血脂癥金黃地鼠血清CHO、TG、LDL，對HDL 無顯著影響[13]，而野菠蘿提取物則顯著降低肥胖模型C57BL/6小鼠CHO、LDL，升高HDL，對TG 無顯著影響。導(dǎo)致實驗結(jié)果差異的原因可能與選用的實驗動物不同有關(guān)，金黃地鼠的膽固醇合成代謝中肝內(nèi)合成途徑所占比例較低[15]，與人類的內(nèi)源性膽固醇中肝臟合成途徑只占10%比較接近，金黃地鼠更多應(yīng)用于高血脂模型評價藥物的降血脂作用[16,17]。大鼠、小鼠的膽固醇肝內(nèi)合成途徑可達60%以上，更多應(yīng)用于肥胖模型[18]。此外，野菠蘿提取物中除含有咖啡酰奎寧酸類成分外，尚還含有其他有效成分，也導(dǎo)致其降血脂效果不同。

最后，本研采用的肥胖模型誘導(dǎo)方法參考了國家食品藥品監(jiān)督管在2012 年4 月23 頒布的保健功能評價方法中關(guān)于減肥功能評價方法的模型，雖然該方法在國內(nèi)得到普遍認可，并且在國際期刊上也發(fā)表了不少文章[19,20]，但仍然存在一定缺點如實驗動物飼料提供方認為在普通飼料中摻入脂肪制作肥胖模型飼料的做法很不嚴謹，很可能導(dǎo)致肥胖模型誘導(dǎo)失敗，出現(xiàn)實驗動物厭食、體重不增加甚至體重減少的情況[21]。因此，選擇專業(yè)的飼料配方和產(chǎn)品是肥胖模型復(fù)制成功的關(guān)鍵之一。此外，對于減肥的藥效評價，尚還缺乏權(quán)威有效的陽性對照藥物。以上爭議，有待今后的工作中進一步完善。