徐佳競(jìng)，石善黨，王中華，任慧莉，汪 勇，李春蓮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由多種鐮刀菌引起的流行性真菌病害，廣泛發(fā)生在世界的溫暖潮濕地帶。在我國(guó)，小麥赤霉病最主要的病原菌是禾谷鐮刀菌群(Fusariumgraminearumcomplex)，占所有病原菌的94.5%[1]。小麥感染赤霉病后，小穗發(fā)黃枯萎，而且籽粒還會(huì)產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等多種真菌毒素，危害人畜健康。為了保障小麥生產(chǎn)安全，尋找有效的赤霉病防治手段并培育高抗赤霉病的小麥品種顯得尤為重要。1974年至今，全國(guó)共計(jì)數(shù)萬(wàn)份小麥材料經(jīng)過(guò)赤霉病抗性鑒定，篩選出了一批優(yōu)秀的抗赤霉病種質(zhì)資源，極大地推動(dòng)了我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)小麥赤霉病抗性的研究進(jìn)程[2-3]。小麥對(duì)赤霉病的抗性分為5種類(lèi)型：抗侵入型、抗擴(kuò)展型、籽?？垢腥尽⒛筒⌒秃涂苟舅胤e累。小麥的株高、芒的有無(wú)、穎殼張開(kāi)程度等穗部形態(tài)特征都會(huì)影響其赤霉病抗性[4-5]。感染赤霉病后，抗病小麥品種的細(xì)胞壁變厚，細(xì)胞壁中的木質(zhì)素大量積累，DON去毒化反應(yīng)速度加快。水楊酸、茉莉酸等多種植物激素、多種酶類(lèi)以及病程相關(guān)蛋白等被證實(shí)與赤霉病抗性相關(guān)[6-7]。目前，研究者已經(jīng)檢測(cè)到數(shù)百個(gè)抗赤霉病QTL，明確的抗赤霉病基因(QTL)有小麥3BS染色體上的Fhb1、6BS染色體上的Fhb2、4B染色體上的Fhb4等[8-9]。

近年來(lái)生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)的快速發(fā)展為全面解析小麥赤霉病抗病機(jī)制帶來(lái)了新途徑。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)樣品整個(gè)cDNA進(jìn)行測(cè)序，可以從轉(zhuǎn)錄層面便捷全面地了解樣品中基因的表達(dá)。Xiao等[10]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)揭示了小麥接種禾谷鐮刀菌后的基因表達(dá)情況。Gottwald等[11]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了抗、感赤霉病的小麥材料接種病菌前后的基因表達(dá)差異，推測(cè)出兩種可能的赤霉病抗性機(jī)制。Schweiger等[12]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法挖掘出了與抗赤霉病相關(guān)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移酶(LTP)基因和UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UTG)基因。同時(shí)，Li[13]通過(guò)基因功能驗(yàn)證證實(shí)，UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因具有赤霉病抗性。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在篩選及挖掘抗病基因方面發(fā)揮著重要作用。

小麥品種西農(nóng)979是由西北農(nóng)林科技大學(xué)育成的冬性早熟、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、綜合抗性強(qiáng)的優(yōu)良品種，于2005年通過(guò)國(guó)審，截止2017年累計(jì)推廣面積約860×104hm2，是關(guān)中和黃淮麥區(qū)重要的小麥品種，經(jīng)中國(guó)農(nóng)科院植保所鑒定，對(duì)赤霉病表現(xiàn)為中抗[14]。張玲麗等[15]經(jīng)過(guò)多年多點(diǎn)跟蹤調(diào)查證實(shí)，西農(nóng)979對(duì)小麥赤霉病具有良好的田間抗性。本研究擬利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，全面分析西農(nóng)979及感病品種周麥18在被禾谷鐮刀菌侵染后的基因表達(dá)差異，為深入挖掘西農(nóng)979的抗病基因及揭示其抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為今后小麥赤霉病抗源的有效利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物材料中抗赤霉病小麥品種西農(nóng)979和感赤霉病小麥品種周麥18均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種新技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。供試材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田及溫室，其中，試驗(yàn)田中的材料用于田間發(fā)病情況調(diào)查，而溫室中的材料用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。供試的禾谷鐮刀菌菌株BN-8由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2 赤霉病田間鑒定方法

采用單花滴注法接種赤霉病菌。開(kāi)花期的小麥在穗軸中部左右兩個(gè)基部小花各接種10 μL禾谷鐮刀菌BN-8孢子液(濃度約為1×105個(gè)·mL-1)，接種后將小穗套袋保濕，20 h后摘袋，接種后第21天觀察記錄赤霉病的發(fā)病情況。依據(jù)《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)—小麥赤霉病測(cè)報(bào)技術(shù)規(guī)范》(GB/T15796-2011)[16]，調(diào)查西農(nóng)979和周麥18出現(xiàn)穗腐癥狀的發(fā)病小穗數(shù)及小穗病情嚴(yán)重度。計(jì)算病情指數(shù)，用以反映病害發(fā)生的平均水平和嚴(yán)重程度。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品的準(zhǔn)備

溫室中，西農(nóng)979和周麥18接種赤霉病菌的方法同1.2。待材料開(kāi)花后，于接種病菌前先取西農(nóng)979的整穗穎殼，然后對(duì)西農(nóng)979和周麥18的小穗接種禾谷鐮刀菌株BN-8，并分別在接種12、24和96 h后取西農(nóng)979與周麥18整穗穎殼，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

樣品總RNA的提取按照RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN, China)試劑盒提供的操作流程進(jìn)行，獲取總RNA后，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, Basle, Switzerland)試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，再經(jīng)cDNA第二鏈合成、末端修復(fù)、連接測(cè)序接頭和電泳切膠回收，得到cDNA，并進(jìn)行測(cè)序。以上工作在北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因表達(dá)定量分析

使用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。測(cè)序產(chǎn)出大量高質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)(Raw data)，經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制得到Clean data。使用HISAT2[17]將中國(guó)春基因組作為參考進(jìn)行序列比對(duì)，利用StringTie[18]對(duì)比對(duì)上的Reads進(jìn)行組裝和定量。采用FPKM[19](Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，對(duì)樣品中Mapped Reads的數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化，使片段數(shù)目能真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。

1.6 差異表達(dá)基因的篩選和功能注釋

使用DEseq[20]進(jìn)行有生物學(xué)重復(fù)的兩組樣品間的差異表達(dá)分析，將Fold Change≥4且FDR<0.001作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)(Fold change)指兩樣品組間表達(dá)量的比值。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)通過(guò)Benjamini-Hochberg校正方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值(Pvalue)進(jìn)行校正得到。隨后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene ontology)(http://www.geneontology.org/)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)(http:// www.genome.jp/kegg)基因注釋和通路富集 分析。

1.7 熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

選取7個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異表達(dá)基因，根據(jù)其全長(zhǎng)cDNA序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，以小麥TaActin基因?yàn)閮?nèi)參(表1)。使用FastKing RT Kit(With gDNase)(TIANGEN, China)試劑盒將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(QPK-201)說(shuō)明書(shū)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，使用ABI 7500 Real-Time PCR System(Life Technologies, America)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，按照2-△△Ct算法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù)。

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 西農(nóng)979和周麥18田間抗病性鑒定結(jié)果

田間抗性鑒定結(jié)果表明，西農(nóng)979病情嚴(yán)重度為0～2級(jí)，其中，0級(jí)2穗，1級(jí)15穗，2級(jí)3穗，75%的接種小穗為1級(jí)，病情指數(shù)為26.25；而周麥18病情嚴(yán)重度為0～4級(jí)，0級(jí)1穗，1級(jí)9穗，2級(jí)2穗，3級(jí)4穗，4級(jí)4穗，病情指數(shù)為51.25。小麥品種西農(nóng)979與周麥18相比，具有較好的赤霉病田間抗性。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及其質(zhì)量控制

本研究取未接種的西農(nóng)979小穗穎殼及接種后12 h、24 h、96 h的西農(nóng)979和周麥18的小穗穎殼，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共計(jì)21組樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。經(jīng)質(zhì)量控制，共獲得135.33 Gb Clean data，每個(gè)處理的測(cè)序深度為6.18～ 6.84 Gb，測(cè)序質(zhì)量Q30堿基百分比在 93.62%～ 94.88%之間，GC含量在53.65%～55.67%之間(表2)。分別將各處理的Clean reads與中國(guó)春參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)效率為 86.05%～89.59%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量好，與參考基因組的比對(duì)率高。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與比對(duì)效率Table 2 Transcriptome sequencing results and alignment efficiency

2.3 差異表達(dá)基因分析

本研究篩選了在接種病菌后12、24、96 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)未接種的西農(nóng)979與接種的西農(nóng)979(稱為對(duì)照組合)之間的差異表達(dá)基因和接種的周麥18與接種的西農(nóng)979(稱為實(shí)驗(yàn)組合)之間的差異表達(dá)基因。結(jié)果(表3)顯示，對(duì)照組合和實(shí)驗(yàn)組合在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)不同數(shù)量的差異表達(dá)基因，24 h時(shí)差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)最多，分別為 3 140和8 864。使用韋恩圖展現(xiàn)差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組合在12、24、96 h時(shí)共同差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)分別為14、1 978、142(圖1A、1B、1C)。其中，有1個(gè)基因在12、24 h時(shí)都出現(xiàn)差異表達(dá)，11個(gè)基因在24和96 h時(shí)都出現(xiàn)差異表達(dá)，沒(méi)有在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)差異表達(dá)的基因(圖1D)。綜合三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，共篩選出2 122個(gè)共同差異表達(dá)基因，這些基因可能與西農(nóng)979的赤霉病抗性有關(guān)。

表3 各樣本間差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of differentially expressed genes between samples

2.4 共同差異表達(dá)基因的GO功能注釋

將2 122個(gè)共同差異表達(dá)基因與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，有1 713個(gè)基因被注釋?zhuān)煞譃樯镞^(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能3個(gè)大類(lèi)和43個(gè)亞類(lèi)(圖2)。其中，生物過(guò)程大類(lèi)含有18個(gè)亞類(lèi)，基因數(shù)量最多的3個(gè)亞類(lèi)是代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和單有機(jī)體過(guò)程，分別為830、735和648個(gè)，此外還有應(yīng)激反應(yīng)、生物調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、解毒作用、免疫系統(tǒng)過(guò)程等亞類(lèi)；細(xì)胞組分大類(lèi)含13個(gè)亞類(lèi)，細(xì)胞部件和細(xì)胞亞類(lèi)包含基因數(shù)最多，均為991個(gè)，其次是細(xì)胞器亞類(lèi)，含851個(gè)，膜、細(xì)胞器部件、膜部件含有的基因也較多，大分子復(fù)合物、細(xì)胞胞外區(qū)域等所含基因較少；分子功能大類(lèi)包含有12個(gè)亞類(lèi)，其中涉及結(jié)合和催化活性的基因最多，分別有805和734個(gè)，其余亞類(lèi)為轉(zhuǎn)運(yùn)活性、電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等。

A：接種后12 h差異表達(dá)基因韋恩圖；B：接種后24 h差異表達(dá)基因韋恩圖；C：接種后96 h差異表達(dá)基因韋恩圖；D：接種后12、24、96 h共同差異表達(dá)基因韋恩圖。

2.5 共同差異基因的KEGG通路富集分析

將共同差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，有405個(gè)基因得到注釋?zhuān)采婕暗?9條信號(hào)通路。這些通路中有70條參與代謝，10條參與遺傳信息過(guò)程，4條參與細(xì)胞過(guò)程，3條參與環(huán)境信息過(guò)程，2條參與有機(jī)系統(tǒng)。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路中富集的基因最多，有48個(gè)，約占11.85%；其次是光合作用-天線蛋白通路，包含41個(gè)差異基因，約占10.12%；淀粉和蔗糖代謝通路中注釋到30個(gè)差異基因，約占7.41%；27個(gè)差異基因參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，約占 6.67%(圖3)。植物-病原體相互作用通路中富集到19個(gè)差異基因，谷胱甘肽代謝、磷酸戊糖途徑等與植物抗性相關(guān)的通路中也含有較多差異基因。此外，KEGG比對(duì)結(jié)果中還涉及多種氨基酸、維生素、糖類(lèi)、酯類(lèi)及萜類(lèi)物質(zhì)的合成代謝通路。在通路富集顯著性上，差異基因在光合作用-天線蛋白、植物晝夜節(jié)律、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、萜骨架的生物合成及類(lèi)胡蘿卜素的生物合成等通路中的富集最為顯著(表4)。

表4 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路Table 4 KEGG pathways significantly enriched by differentially expressed genes

1：代謝過(guò)程；2：細(xì)胞過(guò)程；3：?jiǎn)斡袡C(jī)體過(guò)程；4：應(yīng)激反應(yīng)；5：生物調(diào)控；6：定位；7：細(xì)胞組分組織或生物合成；8：發(fā)育過(guò)程；9：多細(xì)胞組織過(guò)程；10：生殖；11：生殖過(guò)程；12：多有機(jī)體過(guò)程；13：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；14：生長(zhǎng)；15：解毒作用；16：免疫系統(tǒng)過(guò)程；17：生物黏附；18：節(jié)律過(guò)程；19：細(xì)胞部件；20：細(xì)胞；21：細(xì)胞器；22：膜；23：細(xì)胞器部件；24：膜部件；25：大分子復(fù)合物；26：細(xì)胞胞外區(qū)域；27：膜結(jié)合蛋白；28：細(xì)胞連接；29：超分子復(fù)合物；30：細(xì)胞外區(qū)域部分；31：類(lèi)核；32：結(jié)合；33：催化活性；34：轉(zhuǎn)運(yùn)活性；35：電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性；36：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；37：結(jié)構(gòu)分子活性；38：抗氧化活性；39：分子功能調(diào)節(jié)器；40：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；41：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；42：營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性；43：轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合。

2.6 共同差異表達(dá)基因的功能歸類(lèi)及表達(dá)

根據(jù)共同差異表達(dá)基因的注釋情況，對(duì)其進(jìn)行功能歸類(lèi)，有27個(gè)基因被歸入在植物抗病反應(yīng)中扮演重要角色的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中。其中，與生長(zhǎng)素相關(guān)的基因最多，有12個(gè)；與茉莉酸和赤霉素相關(guān)的基因最少，各有3個(gè)；9個(gè)基因與脫落酸有關(guān)(表5)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與乙烯及水楊酸相關(guān)的共同差異表達(dá)基因。此外，有3個(gè)基因參與玉米素生物合成和1個(gè)基因參與油菜素類(lèi)固醇生物合成。在植物—病原體互作通路中有10個(gè)基因參與病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫(PTI)，9個(gè)基因與效應(yīng)子觸發(fā)免疫(ETI)相關(guān)(表5)。PTI中的1個(gè)鈣調(diào)素基因(CALM)也參與磷酸肌醇信號(hào)通路；參與ETI的4個(gè)分子伴侶HtpG基因(HSP90A,htpG)及4個(gè)熱休克蛋白 90 kDa beta基因 (HSP90B,TRA1)也出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路中。此外，還篩選到一些脫毒相關(guān)蛋白基因，包括2個(gè)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因、9個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因和3個(gè)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporter)基因。

表5 共同差異表達(dá)基因功能歸類(lèi)Table 5 Functional classification of common differentially expressed genes

1：胞吞作用；2：過(guò)氧化物酶體；3：吞噬體；4：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；5：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工；6：剪接；7：泛素介導(dǎo)的蛋白水解；8：核糖體；9：蛋白質(zhì)輸出；10：光合作用—天線蛋白；11：淀粉和蔗糖代謝；12：碳代謝；13：苯丙烷生物合成；14：萜類(lèi)骨架的生物合成；15：半乳糖代謝；16：谷胱甘肽代謝；17：氨基酸的生物合成；18：糖酵解/糖異生；19：甘油磷脂代謝；20：半胱氨酸和蛋氨酸的代謝；21：甘油脂代謝；22：類(lèi)胡蘿卜素的生物合成；23：光合作用；24：泛醌和其他萜類(lèi)醌的生物合成；25：磷酸戊糖途徑；26：果糖和甘露糖代謝；27：硫代謝；28：脂肪酸代謝；29：光合生物中的碳固定；30：不飽和脂肪酸的生物合成；31：莨菪烷，哌啶和吡啶生物堿的合成；32：丙酮酸代謝；33：苯丙氨酸代謝；34：酪氨酸代謝；35：?；撬岷团；撬岬拇x；36：類(lèi)固醇生物合成；37：甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的代謝；38：類(lèi)黃酮生物合成；39：氰氨基酸代謝；40：角質(zhì)，琥珀和蠟的生物合成；41：花生四烯酸代謝；42：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成；43：脂肪酸延長(zhǎng)；44：脂肪酸生物合成；45：生物素代謝；46：抗壞血酸和藻酸鹽代謝；47：硫胺素代謝；48：維生素B6代謝；49：晝夜節(jié)律-植物；50：植物病原體相互作用。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中差異基因的表達(dá)情況顯示，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的27個(gè)基因均在接種后24 h于對(duì)照組合和實(shí)驗(yàn)組合中同時(shí)出現(xiàn)差異表達(dá)。其中，蛋白磷酸酶2C基因、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2基因和ABA反應(yīng)元件結(jié)合因子基因上調(diào)表達(dá)；生長(zhǎng)素內(nèi)流載體基因、脫落酸受體PYR/PYL家族基因、冠菌素不敏感蛋白1基因和茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白基因下調(diào)表達(dá)；生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因有2個(gè)下調(diào)表達(dá)，4個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；SAUR家族蛋白基因有2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；光敏色素互作因子基因有1個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。在植物-病原體互作通路的19個(gè)基因中，除鈣調(diào)素基因在接種后96 h同時(shí)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)外，其余18個(gè)基因均在接種后24 h出現(xiàn)差異表達(dá)。其中，鈣結(jié)合蛋白基因、抗病蛋白R(shí)PM1基因、分子伴侶HtpG基因和熱休克蛋白 90 kDa beta基因上調(diào)表達(dá)；絲裂原活化蛋白激酶激酶 4/5基因下調(diào)表達(dá)；WRKY轉(zhuǎn)錄因子33基因在對(duì)照組合中下調(diào)表達(dá)而在實(shí)驗(yàn)組合中上調(diào)表達(dá)。

2.7 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選取分子伴侶HtpG、絲裂原活化蛋白激酶激酶4/5、熱休克蛋白90 kDa beta、冠菌素不敏感蛋白1、ABA反應(yīng)元件結(jié)合因子和生長(zhǎng)素內(nèi)流載體共6個(gè)于24 h時(shí)在對(duì)照組合和實(shí)驗(yàn)組合中同時(shí)呈現(xiàn)差異表達(dá)的基因及在96 h時(shí)出現(xiàn)共同差異表達(dá)的1個(gè)鈣調(diào)素基因，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果(表6)顯示，這些基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得結(jié)果基本一致，證明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確。

表6 熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果對(duì)比Table 6 Comparison of real-time PCR results with RNA-seq results

3 討 論

本研究對(duì)病菌接種后12、24和96 h的西農(nóng)979和周麥18的穎殼進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以未接種的西農(nóng)979穎殼作為對(duì)照，獲得了抗感赤霉病的兩小麥品種經(jīng)禾谷鐮刀菌侵染后的基因表達(dá)情況。將接種的西農(nóng)979與未接種的西農(nóng)979稱為對(duì)照組合，接種的西農(nóng)979與接種的周麥18稱為實(shí)驗(yàn)組合，按對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。對(duì)照組合篩選到的基因反映了西農(nóng)979接種禾谷鐮刀菌后基因表達(dá)的變化情況，包含了西農(nóng)979中所有對(duì)病菌侵染作出響應(yīng)的基因。實(shí)驗(yàn)組合篩選到的基因則反映了西農(nóng)979和周麥18被病菌侵染后基因表達(dá)的差異情況，其中包含赤霉病抗性相關(guān)基因以及因品種不同背景產(chǎn)生的差異表達(dá)基因，不包括兩品種共有的響應(yīng)病菌侵染的部分基因。將篩選到的兩組差異基因取交集，即可排除兩小麥品種種質(zhì)背景的差異，得到西農(nóng)979相對(duì)于周麥18特有的赤霉病抗病基因，這些基因可能賦予了西農(nóng)979比周麥18更強(qiáng)的赤霉病抗性。

共同差異表達(dá)基因的GO功能注釋結(jié)果說(shuō)明，小麥品種西農(nóng)979對(duì)赤霉病的抗性反應(yīng)主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部，涉及細(xì)胞器、膜結(jié)構(gòu)等組分，同時(shí)也發(fā)生在細(xì)胞連接和細(xì)胞外部區(qū)域等部位，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性以及抗氧化活性等分子功能，引起代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和單有機(jī)體過(guò)程為主，生物調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、解毒作用、免疫系統(tǒng)過(guò)程等一系列生物過(guò)程的協(xié)同變化，抵抗病菌的入侵，減輕其毒素的毒害作用。共同差異表達(dá)基因的KEGG通路分析結(jié)果中涉及到的代謝通路可能與西農(nóng)979的赤霉病抗性有關(guān)。除抗病相關(guān)通路外，結(jié)果中還涉及到谷胱甘肽、多種氨基酸、維生素、糖類(lèi)、酯類(lèi)等多種物質(zhì)的合成代謝通路，這些物質(zhì)有些是植物激素的前體物質(zhì)，有些可能對(duì)赤霉病抗性有直接影響，有些則可能進(jìn)一步形成影響赤霉病抗性的物質(zhì)。顯著富集的代謝通路中共同差異基因的富集程度顯著高于其他代謝通路，對(duì)揭示西農(nóng)979赤霉病抗性機(jī)理具有較大參考價(jià)值。在兩組合的共同差異表達(dá)基因中出現(xiàn)了部分與晝夜節(jié)律相關(guān)和光合作用相關(guān)的基因，除了病菌入侵所致外，還可能與樣品的取樣時(shí)間有關(guān)。取樣的時(shí)間不同，植物可能處于不同的生物節(jié)律時(shí)期，相關(guān)基因表達(dá)出現(xiàn)差異，而取樣時(shí)植物所處的不同光照條件會(huì)對(duì)光合作用相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生部分影響。提前處理樣品，統(tǒng)一取樣時(shí)間，有助于減少生物節(jié)律及光照等環(huán)境條件變化造成的干擾。

前人研究表明，遭受病原菌入侵時(shí)，植物會(huì)通過(guò)茉莉酸、水楊酸和乙烯等信號(hào)分子及復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激發(fā)抗病基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)病原菌的抗性[8]。本研究在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中篩選到27個(gè)共同差異表達(dá)基因，涉及生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素和茉莉酸通路。在測(cè)序結(jié)果中沒(méi)有篩選到水楊酸和乙烯等通路的相關(guān)基因，提示這些信號(hào)通路沒(méi)有參與西農(nóng)979赤霉病抗性的產(chǎn)生過(guò)程。事實(shí)上，前人對(duì)水楊酸和乙烯等途徑在小麥赤霉病抗性上所起作用的研究結(jié)果有很大差異。馬 信[6]利用水楊酸處理感病小麥品種的穗部后發(fā)現(xiàn)其赤霉病發(fā)病率顯著下降，認(rèn)為水楊酸在小麥抗赤霉病中起重要作用。而Xiao等[10]在抗病小麥品種望水白和其感病突變體NAUH117的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)水楊酸途徑?jīng)]有參與抗禾谷鐮刀菌侵染的響應(yīng)過(guò)程。本研究關(guān)注了水楊酸信號(hào)通路中的基因在本實(shí)驗(yàn)幾組樣品中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組合僅在病菌侵染96 h時(shí)有2個(gè)病程相關(guān)蛋白(Pathogensis-related protein 1,PR1)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，受到病菌入侵后西農(nóng)979中水楊酸通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)出現(xiàn)了變化，但這兩個(gè)基因在實(shí)驗(yàn)組合中沒(méi)有顯著的表達(dá)差異，說(shuō)明它們不是導(dǎo)致西農(nóng)979比周麥18赤霉病抗性更強(qiáng)的關(guān)鍵基因，我們推測(cè)水楊酸通路與西農(nóng)979的赤霉病抗性無(wú)太大關(guān)系。乙烯雖然是植物防御病原菌入侵的重要觸發(fā)信號(hào)，但乙烯通路對(duì)小麥赤霉病抗性的作用尚存在爭(zhēng)議[7]。本研究沒(méi)有篩選到乙烯通路上的相關(guān)基因，推測(cè)西農(nóng)979的赤霉病抗性與乙烯通路無(wú)關(guān)。以上結(jié)果表明，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素和茉莉酸通路及相關(guān)差異表達(dá)基因與西農(nóng)979的赤霉病抗性有密切的關(guān)系，應(yīng)是后續(xù)研究的重點(diǎn)。植物—病原體互作通路與植物對(duì)病原物入侵的響應(yīng)關(guān)系密切，本研究篩選到7類(lèi)共19個(gè)該通路上的相關(guān)基因，推測(cè)它們?cè)谖鬓r(nóng)979抗禾谷鐮刀菌入侵時(shí)發(fā)揮了重要作用。這些基因有些已被證實(shí)與小麥赤霉病抗性相關(guān)，如小麥中轉(zhuǎn)錄因子TaWRKY45基因超量表達(dá)會(huì)使轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)赤霉病的抗性顯著提高[21]。然而另一些基因與赤霉病抗性相關(guān)的報(bào)道較少，具有進(jìn)一步探究的 價(jià)值。

植物體內(nèi)還有許多具有抗性功能的分子，病程相關(guān)蛋白(PRs)、脫毒相關(guān)蛋白、抗菌肽(AMPs)和一些轉(zhuǎn)錄因子等都可能參與植物的抗病過(guò)程。UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是典型的脫毒相關(guān)蛋白，它能將禾谷鐮刀菌分泌的DON毒素糖基化，減弱其毒性，這是小麥赤霉病抗擴(kuò)展型抗性的一種重要途徑[22]。UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶基因和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因均與禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素類(lèi)(如DON毒素)的去毒化反應(yīng)有關(guān)[23-25]。在本研究中，我們篩選到2個(gè)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因、9個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因和3個(gè)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，這些基因在DON毒素脫毒方面發(fā)揮著重要作用，是西農(nóng)979赤霉病抗性的重要組成部分，有必要進(jìn)一步驗(yàn)證它們的功能，探究它們?cè)谛←湷嗝共】剐苑磻?yīng)中的具體作用機(jī)制。

最近，Su等[26]和Li等[27]分別成功克隆了小麥3BS染色體上的抗赤霉病QTL位點(diǎn)Fhb1，該基因編碼一個(gè)富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白，禾谷鐮刀菌侵染后Fhb1基因的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)。此前，張玲麗等[15]通過(guò)分子鑒定方法發(fā)現(xiàn)西農(nóng)979具有與高抗赤霉病小麥品種蘇麥3號(hào)相同的抗病基因Fhb1。在本研究中，我們使用BLASTn找到了西農(nóng)979和周麥18中3BS染色體上的Fhb1基因，發(fā)現(xiàn)西農(nóng)979中該基因在病菌接種前后表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生顯著變化，而與接種后的周麥18相比，接種后的西農(nóng)979中Fhb1基因的表達(dá)量更低，這說(shuō)明禾谷鐮刀菌的侵染沒(méi)有誘導(dǎo)西農(nóng)979中3BS染色體上Fhb1基因的表達(dá)，該基因可能沒(méi)有參與西農(nóng)979對(duì)小麥赤霉病的抗性反應(yīng)。我們推測(cè)西農(nóng)979中可能還存在著其他抗赤霉病基因。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，鑒定了抗赤霉病小麥品種西農(nóng)979的抗赤霉病基因，揭示了西農(nóng)979在抗小麥赤霉病過(guò)程中的基因調(diào)控情況，為今后進(jìn)一步挖掘小麥抗赤霉病基因、驗(yàn)證基因功能、闡釋小麥抗赤霉病的分子機(jī)制提供了 依據(jù)。