孫康永杰，魏亞琴，楊宇澤，萬學(xué)瑞，樊 杰，趙 波，趙云海，郭容霞，王 川

金黃色葡萄球菌是屬于葡萄球菌科的革蘭氏陽性、凝固酶陽性病原體，是一種直徑約為1 μm的球形細(xì)菌，形成葡萄狀簇，通常無癥狀地出現(xiàn)在人體的某些部位，例如皮膚、皮膚腺體和黏膜，包括健康個體的鼻腔和內(nèi)臟[1]。金黃色葡萄球菌既是共生細(xì)菌，又是人類病原體。大約30%的傷口被金黃色葡萄球菌定殖。同時，它是菌血癥和感染性心內(nèi)膜炎(IE)以及骨關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織、胸膜肺以及與醫(yī)療設(shè)備相關(guān)感染的主要原因[2-7]。金黃色葡萄球菌長期以來一直被認(rèn)為是對人類和獸醫(yī)學(xué)的挑戰(zhàn)[8]。金黃色葡萄球菌被確定為與牛乳腺炎、火雞的腳關(guān)節(jié)感染相關(guān)的病原體[9-10]。在中國，由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致奶牛乳腺炎的發(fā)病率高于其他國家[11]。PRNP編碼的細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein, PrPC)，是一種高度保守、在所有哺乳動物體內(nèi)廣泛表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白；當(dāng)其錯誤折疊成癢病型朊蛋白(scrapie isoform of prion protein, PrPSc)并在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)積累時，將導(dǎo)致傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)的發(fā)生[12]。PRND編碼的Doppel蛋白(Dpl)與朊蛋白(PrPC)均屬于朊蛋白家族。雖然Dpl與PrPC氨基酸序列同源性僅約25%，但兩者翻譯后修飾及空間結(jié)構(gòu)卻非常相似，并且C-端具有相似的結(jié)構(gòu)域，即由3個α-螺旋和2個β-折疊以及2個糖基化位點(diǎn)組成[13]。目前發(fā)現(xiàn)PrPC和Doppel蛋白之間存在拮抗作用[14-15]。PrPC保守性非常強(qiáng)，真核生物的大部分組織均可表達(dá)PrPC，其在哺乳動物體內(nèi)廣泛分布，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)大量存在[16]。目前大量研究發(fā)現(xiàn)，PrPC在全身(人或者動物)多種細(xì)胞通路和信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[17]。而Doppel蛋白在野生型小鼠睪丸和心臟中高水平表達(dá)，脾臟和骨骼肌中表達(dá)程度低，在腦、腎、肝和肺中幾乎不表達(dá)[18]。朊蛋白在細(xì)菌感染中可能發(fā)揮作用，流產(chǎn)布魯氏菌利用腸道M細(xì)胞上的PrPC作為一種侵入性受體[19]。牛分枝桿菌感染導(dǎo)致PRNPmRNA表達(dá)水平逐漸升高[20]。Ingram RJ等人通過實驗證明PrP0/0小鼠在鏈球菌引起的細(xì)菌性敗血癥模型中顯示易感性改變[21]。在感染幽門螺桿菌患者的胃黏膜中PrPC高表達(dá)，在未受感染的胃黏膜中不表達(dá)或低表達(dá)[22]。雖然PRNP在細(xì)菌感染中發(fā)揮功能，但是Doppel蛋白的具體生理功能尚未確定。朊蛋白家族中的PRND在細(xì)菌感染過程中發(fā)揮什么樣的功能？感染金黃色葡萄球菌后對PRNP和PRND表達(dá)有什么變化？我們?nèi)匀徊磺宄Ｒ虼?，本實驗通過金黃色葡萄球菌ATCC25923人工感染小鼠，研究PRNP和PRND在金黃色葡萄球菌感染后的表達(dá)變化，探討金黃色葡萄球菌感染與PRNP和PRND的關(guān)系，為PrPC和Doppel蛋白在細(xì)菌感染中的作用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑與儀器

1.2實驗動物及菌株 24只BALB/c雌鼠購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。金黃色葡萄球菌ATCC25923由甘肅省人民醫(yī)院魏蓮花老師饋贈。

1.3 方 法

1.3.1細(xì)菌接種與培養(yǎng) 將金黃色葡萄球菌ATCC25923接種于高壓滅菌后的TSB液體培養(yǎng)基(100 mL)，接種前加入5%羊血清(用0.45 μm濾器過濾)，放置于搖床中37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600介于0.6～0.8之間。

1.3.2感染BALB/c雌鼠 將菌液離心，加入適量PBS緩沖液稀釋至OD600值等于0.6。將24只BALB/c雌鼠分為空白對照組和第1 d、第2 d、第3 d、第4 d、第5 d、第6 d、第7 d感染組。其中空白對照組3只，感染組每組3只。感染組BALB/c雌鼠在腹部皮下分四點(diǎn)注射0.1 mL金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液。空白對照組相同方法在BALB/c雌鼠在腹部皮下分四點(diǎn)注射0.1 mL注射PBS緩沖液。

1.3.3解剖小鼠 在金黃色葡萄球菌ATCC25923感染后第1 d、第2 d、第3 d、第4 d、第5 d、第6 d、第7 d解剖對應(yīng)各組小鼠，每只小鼠摘取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、小腸、大腸、卵巢和子宮。每組所有組織器官分為3部分，第一部分置于裝有1 mL 10%甲醛的1.5 mL滅菌EP管中，第二部分組織器官抹片，最后一部分直接裝于1.5 mL滅菌EP管中置于-80 ℃冰箱。

1.3.4感染組織抹片革蘭氏染色及石蠟切片制作 感染組織抹片革蘭氏染色，油鏡觀察，發(fā)現(xiàn)腎臟中最先出現(xiàn)金黃色葡萄球菌，所以采取腎臟制作石蠟切片[23]。

1.3.5引物設(shè)計與合成 采用Oligo 6軟件，依照熒光定量引物設(shè)計準(zhǔn)則，在保守區(qū)域設(shè)計特異性引物。引物交由金唯智生物科技有限公司合成。見表1。

表1 引物序列及大小

1.3.6熒光定量PCR檢測小鼠腎臟中PRNP基因和PRND基因的表達(dá) 將存放于-80 ℃冰箱的腎臟組織留樣按照TRIzol說明書提取總RNA。取1 μL RNA溶液加入到超微量分光光度計中測定總RNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，熒光定量PCR方法參照文獻(xiàn)[24]。具體條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)，延伸階段收集信號，qPCR結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析，驗證引物擴(kuò)增的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因，以空白組為對照，采用比較Ct值相對定量法(2-ΔΔCt)來分析不同感染時間PRNP與PRND基因的表達(dá)量[25]，數(shù)據(jù)使用SPSS 25進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1金黃色葡萄球菌感染小鼠的病理變化 小鼠在第1 d和第2 d與空白對照組相比無明顯變化。從感染后第3 d開始，小鼠變得精神沉郁，飲水量和食量開始下降，到第7 d最為嚴(yán)重，抓取時甚至出現(xiàn)不反抗的現(xiàn)象，第5 d解剖時發(fā)現(xiàn)腹部注射部位發(fā)生病變，皮膚有輕微膿腫，打開腹腔后，聞到明顯的腐臭味。與空白對照相比，第3 d至第7 d的組織器官發(fā)生不同程度的病理變化，尤其是腹腔器官，肝臟顏色變深，質(zhì)地變脆，體積腫大。腎臟、脾臟、卵巢發(fā)生腫脹，小鼠的糞便變稀，血液顏色變深。

2.2金黃色葡萄球菌感染小鼠腎臟的革蘭氏染色結(jié)果 以革蘭氏染色的情況來看，小鼠的內(nèi)臟器官從第2 d開始出現(xiàn)金黃色葡萄球菌，每天細(xì)菌出現(xiàn)的數(shù)量都在遞增，其中腎臟感染最早且較為嚴(yán)重。所以選取腎臟做后續(xù)實驗。見圖1。

A.空白對照；B.第1 d；C.第2 d；D.第3 d E.第4 d；F.第5 d；G.第6 d；H.第7 d

2.3金黃色葡萄球菌感染小鼠腎臟組織的變化 與空白對照組相比，感染后第3 d腎小球炎性細(xì)胞增生，腎小管間局部輕微出血；感染后第4 d腎小管彌漫性腫脹，管腔狹窄；感染后第5 d腎臟間質(zhì)炎性細(xì)胞增生，腎小管腫脹，間質(zhì)局部出血。見圖2。

A.空白對照；B.第3 d；C.第4 d；D.第5 d

2.4熒光定量PCR測定PRNP、PRND表達(dá)量結(jié)果 利用熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌ATCC25923感染BALB/c雌鼠后1～7 d腎臟中PRNP基因與PRND基因的相對表達(dá)量，以空白組作為對照，PRNP基因第1 d到第7 d的相對表達(dá)量分別是：6.147 5±0.166 4(P=7.188 9×10-18)，3.031 4±0.169 7(P=7.186 6×10-12)，2.345 6±0.162 8(P=1.160 9×10-9)，2.143 5±0.114 0(P=5.448 6×10-8)，3.387 0±0.044 7(P=1.916 1×10-12)，2.907 9±0.064 0(P=2.572×10-11)和2.329 4±0.141 4(P=8.479×10-9)，均顯著高于對照組(P<0.05)，其中第1 dPRNP相對表達(dá)量最高；PRND基因第1 d到第7 d的相對表達(dá)量分別是：9.253 5±0.112 6(P=3.965 7×10-21)，13.086 4±0.102 1(P=1.012 5×10-23)，3.580 1±0.161 0(P=3.544×10-13)，1.972 5±0.111 9(P=1.995 2×10-7)，3.732 1±0.090 2(P=1.932 2×10-13)，1.189 2±0.064 0(P=0.144)和4.438 3±0.149 2(P=5.157 7×10-15)，PRND基因第6d的相對表達(dá)量和對照組差異無統(tǒng)計，其余各天PRND基因的相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)，其中第2 dPRND相對表達(dá)量最高。見圖3。

圖3 PRNP基因和PRND基因的相對表達(dá)水平(①：P<0.05；②：P>0.05)

3 討 論

金黃色葡萄球引起的菌血癥可并發(fā)心內(nèi)膜炎、轉(zhuǎn)移性感染或敗血癥綜合征。內(nèi)皮細(xì)胞是這些疾病致病過程的中心，而單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在感染過程起中心作用[26]。PrPC是細(xì)胞表面上糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的糖蛋白，先前的研究已經(jīng)證明PrPC與巨噬細(xì)胞的吞噬能力有關(guān)[27]。此次實驗發(fā)現(xiàn)小鼠腹部皮下注射金黃色葡萄球菌2 d后，在腎臟最先發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌，且腎臟感染較為嚴(yán)重，腎臟感染屬于轉(zhuǎn)移性感染。從HE染色結(jié)果可看出金黃色葡萄球菌感染造成小鼠腎臟組織腎小球炎性細(xì)胞增生，腎小管腫脹以及間質(zhì)局部出血，腎臟間質(zhì)炎性細(xì)胞增生。感染金黃色葡萄球菌后，PRNP的表達(dá)在1～7 d內(nèi)都高于空白對照組。其中第1 d表達(dá)量最高，雖然從第2 d開始下降，但都維持在空白對照組的2倍以上。PRND的表達(dá)量也都高于空白對照，第1 d和第2 d最為明顯，從第3 d開始相對表達(dá)量下降。而朊蛋白在哺乳動物機(jī)體內(nèi)廣泛分布，可能參與機(jī)體多種生理功能的維持[28]。表達(dá)于腸上皮細(xì)胞中M細(xì)胞表面的PrPC通過與細(xì)菌表面的Hsp60相互作用，在流產(chǎn)布魯氏菌進(jìn)入M細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[19]。在鏈球菌感染過程中，PRNP基因敲除的小鼠T細(xì)胞激活程序的某些組成部分被終止，而這些組成部分是完全有效的超抗原或抗原反應(yīng)所必需的，PrPC表達(dá)似乎與誘導(dǎo)免疫效應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)[21]。PrPC通過調(diào)控促炎細(xì)胞因子上調(diào)和抑制細(xì)胞凋亡途徑，從而參與小膠質(zhì)細(xì)胞對牛分枝桿菌感染的反應(yīng)調(diào)節(jié)[20]。而幽門螺桿菌感染伴隨著胃黏膜中PrPC表達(dá)的急劇上調(diào)，這與本實驗結(jié)果一致[22]。本實驗發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟的PRNP和PRND的表達(dá)隨著金黃色葡萄球菌感染時間發(fā)生變化，暗示這兩種蛋白可能直接或者間接參與了小鼠機(jī)體抵抗感染的過程，同時這也是我們首次證實PRND的表達(dá)隨著金黃色葡萄球菌感染時間發(fā)生變化。PrPC和Doppel蛋白在感染過程中并沒有表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，而PRNP和PRND表達(dá)同時上調(diào)的具體原因需要進(jìn)一步研究。

利益沖突：無