鐘立強(qiáng)，王明華，張世勇，姜虎成，陳校輝，朱廣偉，邊文冀*

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京210017；2.中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所 湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站，南京210008；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

中國(guó)是全球最大的漁業(yè)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品消費(fèi)國(guó)家，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%以上[1]。而內(nèi)陸淡水池塘養(yǎng)殖又是其中最主要的養(yǎng)殖方式，2018 年養(yǎng)殖面積達(dá)252.7 萬(wàn)hm2，養(yǎng)殖產(chǎn)量2 212.2 萬(wàn)t，占全國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量的32.9%[2]。池塘養(yǎng)殖時(shí)，強(qiáng)調(diào)“養(yǎng)魚(yú)先養(yǎng)水”，即魚(yú)苗在下塘養(yǎng)殖前，要提前對(duì)養(yǎng)殖池塘的水體進(jìn)行施肥等管理工作，使得養(yǎng)殖水體保持“肥、活、嫩、爽”。從生態(tài)學(xué)角度講，這個(gè)過(guò)程就是通過(guò)施肥加速養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化，促進(jìn)藻類及浮游動(dòng)物的生長(zhǎng)，從而提高水體生產(chǎn)力，為魚(yú)類提供充足的生物餌料，形成相對(duì)穩(wěn)定并適合魚(yú)類生活的微生態(tài)環(huán)境。

與自然水域生態(tài)系統(tǒng)不同，淡水池塘養(yǎng)殖是特殊的人為操縱生態(tài)系統(tǒng)。充足的營(yíng)養(yǎng)鹽通過(guò)上行效應(yīng)提高魚(yú)類產(chǎn)量的同時(shí)，大量投入的有機(jī)質(zhì)也為池塘生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)的腐屑鏈提供了能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)菌在腐屑鏈中占據(jù)著重要地位，一方面細(xì)菌起著降解作用，是物質(zhì)和能量的貯存者，另一方面，它們是重要的生產(chǎn)者，能夠?qū)⒂袡C(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)菌菌體蛋白，直接被浮游動(dòng)物和魚(yú)類攝食[3]。已有研究表明，細(xì)菌群落與水體的營(yíng)養(yǎng)水平及浮游植物的生物量存在明顯關(guān)系[4-5]。養(yǎng)殖池塘中，由于富營(yíng)養(yǎng)化和魚(yú)類的牧食壓力，小型浮游植物和浮游動(dòng)物占據(jù)優(yōu)勢(shì)[6]，進(jìn)而可能對(duì)池塘生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)造成影響。因此，對(duì)養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)開(kāi)展研究十分必要。本文采用16S rRNA 基因片段高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)南京斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）淡水養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落的周年變化開(kāi)展了研究，目的主要是：（1）了解斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落組成、多樣性的年度變化特點(diǎn)；（2）明確斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。這些研究結(jié)果將對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體的精細(xì)化管理和健康養(yǎng)殖提供幫助。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖池塘及樣品采集

試驗(yàn)在江蘇省淡水水產(chǎn)研究所國(guó)家斑點(diǎn)叉尾鮰遺傳育種中心養(yǎng)殖基地開(kāi)展。養(yǎng)殖池塘面積0.21 hm2（50 m×42 m），位于南京市江寧區(qū)祿口鎮(zhèn)（31°77′03″N，118°88′29″E）。養(yǎng)殖開(kāi)始前一個(gè)月抽干池水，漂白粉清塘后，加水至1.5 m左右，池塘中央設(shè)置一臺(tái)增氧機(jī)。4—10 月，每晚23：00 開(kāi)啟增氧機(jī)至次日凌晨4：00，晴天中午11：00 點(diǎn)開(kāi)啟2 h，保證養(yǎng)殖水體溶氧充足。夏季每月月中補(bǔ)水，春秋季則每2 月補(bǔ)水一次。池塘內(nèi)放入2 747 尾斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種（平均18.91 g·尾-1），養(yǎng)殖從11月底至次年12月初。每日早晚兩次投喂漂浮性顆粒配合飼料（蛋白含量35%），飼料投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的3%左右。

養(yǎng)殖周期內(nèi)，每月的月末開(kāi)展水樣采集。每次上午10：00，利用Schindler 采水器（5 L）采集3處池塘表層50 cm 的水樣，放入滅菌塑料瓶。水樣放入4 ℃保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，分析時(shí)樣品為3 個(gè)點(diǎn)水樣的混合樣。取300 mL 混合水樣經(jīng)0.22 μm 的聚碳酸酯膜（Millipore，Cork，Ireland）負(fù)壓過(guò)濾，得到濾膜樣品，放入2 mL 的無(wú)菌離心管，-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，留待DNA 提取。另取200 mL 混合水樣4 ℃低溫保存，進(jìn)行水質(zhì)的化學(xué)因子分析。

1.2 池塘水質(zhì)因子測(cè)定

利用多功能水質(zhì)參數(shù)儀（YSI6920v2，USA）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溫度（Temp）、酸堿度（pH）、總?cè)芙庑詰腋∥铮═DS）、濁度（Tur）以及溶解氧（DO）等環(huán)境因子。塞氏盤(pán)測(cè)定水體透明度（SD）。其他水質(zhì)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按以下方法測(cè)定：總氮（TN）采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB 11894—1989）；銨態(tài)氮（NH-N）采用納氏試劑分光光度法（GB 7479—1987）；硝態(tài)氮（NO-N）采用酚二磺酸分光光度法（GB 7480—1987）；亞硝態(tài)氮（NO-N）采用分光光度法（GB 7493—1987）；總磷（TP）和正磷酸鹽（PO-P）采用磷鉬藍(lán)比色法（HJ 670-2013）；總有機(jī)碳（TOC）采用燃燒-非分散紅外吸收法（GB 13193—1991）；化學(xué)需氧量（CODMn）采用高錳酸鉀滴定法（GB 11892—1989）。水樣經(jīng)Whatman GF/C 0.45μm濾膜過(guò)濾后，分光光度法（HJ 897—2017）測(cè)定葉綠素a（Chl a）含量。

1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增

水樣過(guò)濾收集濾膜，用預(yù)先經(jīng)75%酒精擦拭過(guò)的醫(yī)用剪刀剪碎后，利用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒（Qiagen，CA，USA）提取微生物總DNA。提取的DNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度及純度后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以通用引?38F 和806R 擴(kuò)增16S rRNA 基因V3-V4 高變區(qū)[7]，建庫(kù)及高通量測(cè)序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)優(yōu)化與分析

生物信息學(xué)分析前，先用Trimmomatic軟件[8]去除測(cè)序原始序列的引物和barcode 標(biāo)簽，再用FLASH 軟件[9]對(duì)序列進(jìn)行拼接，使用VSEARCH（1.9.6）將序列以97%相似性聚類成操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs），比對(duì)的參考數(shù)據(jù)庫(kù)是Silva_132 16SrRNA database（http：//www.arb-sliva.de）[10]。

所有統(tǒng)計(jì)分析及可視化分析均利用R 語(yǔ)言中的vegan和ggplot2程序包（Version 3.2.2）以及上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-sanger 云平臺(tái)完成。多樣性分析前，根據(jù)每個(gè)樣本中最少的序列數(shù)進(jìn)行抽平。利用mothur 軟件計(jì)算α 多樣性[11]。計(jì)算β 多樣性前，對(duì)抽平后的物種數(shù)據(jù)進(jìn)行Hellinger 轉(zhuǎn)化[12]，再進(jìn)行非度量多維尺度分析（Nonmetric multi-dimensional scaling，NMDS）[13]。對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行999次Monte Carlo置換檢驗(yàn)的前向選擇后，采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對(duì)環(huán)境因子與微生物群落進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析[14]。采用相似性分析（Analysis of similarities，ANOSIM）檢驗(yàn)季節(jié)間差異。最后，通過(guò)多物種線性差異判別分析（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe），根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同分組條件進(jìn)行線性判別分析（LDA），找出具有季節(jié)顯著性差異的菌群[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體理化特征

年度養(yǎng)殖試驗(yàn)過(guò)程中，水溫（Temperature）呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化，從冬季的1月末逐步升高，夏季7月末達(dá)到峰值33.78 ℃，之后緩慢下降，除春季和秋季外，其他季節(jié)間水溫都存在顯著性差異（P＜0.05）?？?cè)芙庑詰腋∥铮═DS）和水體透明度（SD）都呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)，且都是冬春季顯著高于夏秋季（P＜0.05）。全年水樣pH 介于7.68～9.50，始終保持偏堿性，冬季水體的堿性顯著強(qiáng)于夏季（P＜0.05）。水體溶氧（DO）含量為6.12～16.39 mg·L-1，適合魚(yú)類養(yǎng)殖，冬季水體的溶氧含量也顯著高于其他3 個(gè)季節(jié)（P＜0.05）。水體總氮（TN）和總磷（TP）濃度始終維持較高水平，一直處于富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)，四季間TN 變化不大，但冬季TP 濃度顯著低于夏秋季節(jié)（P＜0.05）。氨氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽（NO-2-N）、硝酸鹽（NO-3-N）隨季節(jié)的變化表現(xiàn)出一定的差異，但正磷酸鹽（PO3-4-P）則全年無(wú)顯著性變化。總有機(jī)碳（TOC）也表現(xiàn)為冬春季顯著高于夏秋季（P＜0.05）。葉綠素a（Chl a）夏秋季要高于冬春季，其中夏季顯著高于其他3 個(gè)季節(jié)，并在7 月達(dá)到年度峰值，冬季的葉綠素a 濃度最低。水體理化特征見(jiàn)表1。

表1 斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體理化性質(zhì)Table 1 Summary of physicochemical parameters for water samples of channel catfish pond

2.2 微生物群落多樣性特征

經(jīng)優(yōu)化處理后，共獲得356 877條序列，平均每個(gè)樣品有29 741 條高質(zhì)量序列，序列平均長(zhǎng)度為434.55 bp。這些序列被聚類為1 023 個(gè)OTUs。稀釋曲線分析中所有樣本的都接近平緩，表明本次試驗(yàn)抽樣充分，測(cè)序深度足以反映每個(gè)樣本細(xì)菌群落的生物信息。

選取Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simp-son指數(shù)用來(lái)反映養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性。結(jié)果顯示（圖1），養(yǎng)殖年度內(nèi)，Ace 指數(shù)和Chao1指數(shù)變化趨勢(shì)較為一致：冬春季呈S形變化，最小值出現(xiàn)在冬季2 月，并與相鄰的1 月以及初春的3 月形成細(xì)菌群落物種豐富度的小低谷，之后的3 個(gè)月又持續(xù)上升；7 月Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)大幅下降，之后鋸齒狀震蕩上升，并在10 月達(dá)到年度最大值。使用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)4 個(gè)季度的Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，兩個(gè)指數(shù)只有秋季和冬季之間存在顯著性差異（P＜0.05）。年度內(nèi)養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)變化趨勢(shì)呈相反的趨勢(shì)，表明細(xì)菌群落多樣性變化相對(duì)穩(wěn)定，預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致。Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)為對(duì)應(yīng)的“山”字狀，7月是細(xì)菌群落多樣性的最低值，且與其他月份差別較大，3月則是倒數(shù)第二低值，其他月份變化都不大（圖1）。單因素方差分析與多重比較（ANOVA）結(jié)果顯示，4 個(gè)季度Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體微生物群落α多樣性Figure 1 The alpha diversity of bacterial community in channel catfish pond

使用非度量多維尺度分析（NMDS）展示養(yǎng)殖池塘水樣細(xì)菌群落的β 多樣性。NMDS 分布圖（圖2A）顯示，所有樣本呈現(xiàn)出較好的季節(jié)性排列趨勢(shì)，即4個(gè)季度的樣本可以被明顯地區(qū)分，同一季度內(nèi)的樣品間距離更近，其微生物群落也更加相似。同時(shí)，整個(gè)年度水體細(xì)菌群落也呈現(xiàn)出連續(xù)的演替特征，從排序圖的左側(cè)連續(xù)往右排列，只有夏季樣品的群落稍有例外，與秋季略有重疊，但整體排在右側(cè)。NMDS 分析的Stress值為0.042，也表明排序結(jié)果可靠。細(xì)菌群落層次聚類分析的結(jié)果與NMDS類似，所有群落聚為兩簇（圖2B）：夏季和秋季樣品（11 月樣品除外）聚為一簇，冬季和春季的樣品聚為另一簇。各分簇內(nèi)部，每個(gè)季節(jié)的樣品也聚類為一支。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

1 023 個(gè)OUT 被注釋為27 個(gè)門(mén)（Phyla）、60 個(gè)綱（Classes）和347個(gè)屬（Genera）。為了減少群落的復(fù)雜性和冗余性，相對(duì)豐度低于1%的群落都?xì)w為稀有種，并為“Others”[16]。

養(yǎng)殖池塘水體樣本中OTU 數(shù)量從高到低呈現(xiàn)為秋季＞春季＞夏季＞冬季。4個(gè)季節(jié)樣本共享的OUT有324個(gè)，占全部OTU 的31.67%，3個(gè)季節(jié)和2個(gè)季節(jié)樣品間共享OUT分別為274個(gè)和267個(gè)，占比26.78%和26.09%。而單季樣品獨(dú)有的OUT 數(shù)量最少，只有158個(gè)，占比15.44%。其中，冬季和秋季樣品獨(dú)有OUT 最多，分別為48個(gè)和47個(gè)，占比4.69%和4.59%，夏季樣品獨(dú)有OUT最少，僅29個(gè)，占比2.83%。

圖2 斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體微生物群落NMDS排序圖和層級(jí)聚類分析Figure 2 NMDS plot and hierarchical clustering analysis of the compositional dissimilarities of the bacterial communities

ANOSIM 檢驗(yàn)表明4個(gè)季度養(yǎng)殖池塘水體樣品間細(xì)菌群落組成存在顯著性差異（P＜0.01）。然而，分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，所有樣品在門(mén)水平上組成較為相似。相對(duì)豐度從高到低依次為：藍(lán)藻門(mén)Cyanobacteria（29%）、放線菌門(mén)Actinobacteria（25%）、變形菌門(mén)Proteobacteria（20%）和 擬 桿 菌 門(mén) Bacteroidetes（12%），這4 個(gè)門(mén)占全部群落的86%。而疣微菌門(mén)Verrucomicrobia（3.9%）、浮 霉 菌 門(mén)Planctomycetes（3.2%）、厚壁菌門(mén)Firmicutes（2.5%）、綠菌門(mén)Chlorobi（1.8%）和綠彎菌門(mén)Chloroflexi（1.4%）相對(duì)豐度都低于4%。

門(mén)水平上，冬季水體樣品中放線菌門(mén)相對(duì)豐度最高，之后依次為變形菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)以及擬桿菌門(mén)。而春、夏、秋3 季的水體樣品中藍(lán)藻門(mén)相對(duì)豐度最高，之后分別為放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。各個(gè)季度樣品內(nèi)其他菌門(mén)的相對(duì)豐度都低于5%。從時(shí)間角度上看，養(yǎng)殖池塘水體中4 個(gè)主要菌門(mén)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)出截然不同的變化趨勢(shì)（圖3）。藍(lán)藻門(mén)的相對(duì)豐度呈單峰形變化，夏季達(dá)到最高峰（37%），春秋季略有下降（30%和32%），冬季最低（17.45%）。其中，3 月和7 月水體中藍(lán)藻門(mén)相對(duì)豐度出現(xiàn)了兩次明顯的升高，分別為49.97%和56.77%。放線菌門(mén)相對(duì)含量則表現(xiàn)為增長(zhǎng)的趨勢(shì)，從春季的20%一直增加至冬季的29%。變形菌門(mén)1 年內(nèi)的相對(duì)豐度保持相對(duì)穩(wěn)定，維持在20%左右。擬桿菌門(mén)則呈U字形變化，即冬春季高（15%左右），夏秋季低（8.5%）。

4 個(gè)季度樣品間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較顯示，厚壁菌門(mén)、綠菌門(mén)和Saccharibacteria門(mén)存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，冬春季的厚壁菌門(mén)相對(duì)數(shù)量顯著高于夏秋季，綠菌門(mén)相對(duì)數(shù)量則是夏秋季顯著高于冬春季，而秋季Saccharibacteria 門(mén)的相對(duì)數(shù)量顯著高于其他3個(gè)季節(jié)。

圖3 斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體微生門(mén)級(jí)水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的年度變動(dòng)Figure 3 Annual dynamic of bacterial community composition at the phylum level

屬水平上，養(yǎng)殖池塘水體的優(yōu)勢(shì)菌屬為hgcI_clade、藍(lán)細(xì)菌屬norank_c__Cyanobacteria、聚球藻屬Syn?echococcus、CL500-29、CL500-3和多核桿菌屬Polynu?cleobacterium。聚類熱圖表明，屬水平上，所有樣品聚為冬春和夏秋兩簇（圖4）。其中，腸球菌屬Enterococ?cus、芽孢桿菌屬Bacillus、乳球菌屬Lactococcus、單胞菌屬Polaromonas、紅育菌屬Rhodoferax和黃桿菌屬Flavobacterium的相對(duì)豐度在冬春季明顯高于夏秋季。而甲基嗜酸菌屬Candidatus_Methylacidiphilum、球衣菌屬Sphaerotilus、玫瑰單胞菌屬Roseomonas、不動(dòng)桿菌屬Acidibacter和湖沉積桿菌屬Limnobacter的相對(duì)豐度則是夏秋季明顯高于冬春季。

2.4 季節(jié)差異性菌群分析

圖4 養(yǎng)殖池塘水體微生物屬級(jí)水平的分層聚類熱圖Figure 4 Bacterial community heatmap analysis in genus level

4個(gè)季度樣品間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較在3個(gè)菌門(mén)發(fā)現(xiàn)了顯著性差異，在時(shí)間維度上進(jìn)一步采用LefSe軟件對(duì)養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落樣本進(jìn)行線性判別分析（LDA），以找到各個(gè)季節(jié)顯著性對(duì)應(yīng)的群落或物種。對(duì)LDA 判別值大于3.5 的細(xì)菌類群進(jìn)行分析，共有不同分類水平的53個(gè)細(xì)菌類群，在4個(gè)季節(jié)間具有顯著差異（圖5）。春、夏和秋3 個(gè)季節(jié)的顯著優(yōu)勢(shì)種相對(duì)集中，主要分布于一兩個(gè)門(mén)。其中，春季的水體中，優(yōu)勢(shì)性菌群主要集中于厚壁菌門(mén)中的腸球菌屬Entero?coccus，以及藍(lán)藻門(mén)中的SubsectionIV。夏季水樣中，優(yōu)勢(shì)性菌群集中于變形菌門(mén)中的δ-變形菌綱Deltaproteobacteria，寡彎菌屬Oligoflexaceae，以及變形菌門(mén)中的球衣菌屬Sphaerotilus和藍(lán)藻門(mén)中的顫藻屬Oscillatoria。秋季的樣品優(yōu)勢(shì)菌群則主要集中于綠菌門(mén)中的OPB56 屬、Saccharibacteria 門(mén)，以 及 藍(lán) 藻 門(mén) 中 的 屬FamilyI和變形菌門(mén)中的紅螺菌目Rhodospirillales 與玫瑰單胞菌屬Roseomonas。冬季具有顯著優(yōu)勢(shì)菌群最多，共有2 個(gè)綱、6 個(gè)目、9 個(gè)科和10 個(gè)屬。其中，疣微菌門(mén)中的疣微菌綱Verrucomicrobiae 疣微菌科Verrucomicrobiaceae、豐佑菌綱OpitutaeVadin中的HA64屬、放線菌門(mén)中的PeM15 綱、從棒狀桿菌綱Corynebacteriales中的分枝桿菌屬M(fèi)ycobaterium、厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌目Bacillales 芽孢桿菌屬Bacillus、鏈球菌科Streptococcaceae 乳球菌屬Lactococcus、變形菌門(mén)中的紅細(xì)菌目Rhodobacterales 到紅桿菌屬Rhodobacte?raceae、MNG 科、以及其他零星分布的普雷沃氏菌科Prevotellaceae、球形紅桿菌屬Candidatus_Aquirestis、嗜甲基菌屬M(fèi)ethylotenera、單胞菌屬Polaromona和Limnohabitans屬。

圖5 斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘四季間差異性菌群多物種線性差異判別分析Figure 5 LEfSe identified the most differentially abundant taxa in the channel catfish pond among four seasons

2.5 細(xì)菌群落變化影響因素

與樣本菌群組成相關(guān)的環(huán)境因子很多，但其中部分因子存在共線性，所以先進(jìn)行篩選，保留相互作用較小的環(huán)境因子。方差膨脹因子（Variance inflation factor，VIF）分析表明自變量間的多重共線性關(guān)系嚴(yán)重，過(guò)濾掉VIF 大于20的環(huán)境因子NO-3-N 和Chl a，多次篩選后，剩下的環(huán)境因子對(duì)應(yīng)的VIF 值全部小于20。Monte Carlo 排序檢驗(yàn)表明Temp、TDS、pH、NO2-N、TOC與細(xì)菌群落之間存在顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。這5個(gè)因子對(duì)細(xì)菌群落格局的影響大?。╮2）依次順序是：TDS＞Temp＞pH＞NO-2-N＞TOC（表2）。

利用前置檢驗(yàn)挑選出來(lái)的5 個(gè)與細(xì)菌群落顯著相關(guān)的環(huán)境因子進(jìn)行RDA 排序分析，結(jié)果表明，RDA1 軸和RDA2 軸分別解釋了細(xì)菌群落變異的44.53%和10.98%，主要菌群被聚為2 簇（圖6）。第1簇由冬季和春季樣品組成，第2 簇由夏季和秋季樣品組成，兩簇被RDA2軸分隔。其中，第1簇冬春季樣本分布比較緊密，主要受pH、TOC和TDS的影響；第2簇夏秋季樣本分布較為分散，且夏秋季樣品被RDA1 軸分 隔，主 要 受NO-2-N 和Temp 的 影 響。RDA 結(jié) 果 顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體微生物具有比較明顯的季節(jié)性，4個(gè)季節(jié)的樣品沿著RDA1軸從左往右排列。

3 討論

本文通過(guò)分析斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落的年度變化過(guò)程，闡明斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落的變化規(guī)律。研究表明，養(yǎng)殖池塘的微生物群落與營(yíng)養(yǎng)鹽、水質(zhì)、養(yǎng)殖對(duì)象及日常管理都具有重要的關(guān)系[3]。本研究結(jié)果表明，斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)藻門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，與三疣梭子蟹和吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖塘水體較為相似，但是主要優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度排序略有差別[17-18]。不同養(yǎng)殖品種，甚至同一養(yǎng)殖品種的不同養(yǎng)殖階段，其養(yǎng)殖水體的微生物群落都有明顯的差別，這與養(yǎng)殖對(duì)象的棲息方式、食性特征以及養(yǎng)殖周期等差異有關(guān)[18]。斑點(diǎn)叉尾鮰和吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中投餌量大，產(chǎn)生大量的殘餌和糞便，往往造成過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物輸入至養(yǎng)殖池塘，同時(shí)，斑點(diǎn)叉尾鮰和羅非魚(yú)都是底棲性魚(yú)類，因此優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落較為相似。

ANOSIM 檢驗(yàn)表明斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體4個(gè)季度樣品間細(xì)菌群落組成存在顯著性差異（P＜0.01），NMDS 分析（圖2A）也驗(yàn)證了所有樣本呈現(xiàn)出較好的季節(jié)性排列趨勢(shì)。斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體優(yōu)勢(shì)菌中，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度冬春季顯著高于夏秋季節(jié)，LefSe 分析進(jìn)一步表明，主要差異菌群為冬季的普雷沃氏菌科Prevotellaceae、球形紅桿菌屬Candida?tus_Aquirestis。普雷沃氏菌科Prevotellaceae 能夠利用和降解蛋白質(zhì)及各類有機(jī)物[19]，而斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘的總有機(jī)碳顯著高于夏秋季節(jié)，為普雷沃氏菌科細(xì)菌的繁殖提供了適合的環(huán)境。球形紅桿菌屬Candi?datus_Aquirestis廣泛分布于內(nèi)陸高硬度水體，冬春季也會(huì)在自然水體中形成明顯的生物量高峰，秋冬季則維持較低的豐度[20]，與斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體的明顯季節(jié)性變化一致。

表2 環(huán)境因子對(duì)排序結(jié)果的相關(guān)性系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)值Table 2 Coefficient correlations between physicochemical parameters and RDA axis

圖6 細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的RDA分析Figure 6 RDA bioplot of the distribution of bacterial community and environmental variables

藍(lán)藻門(mén)作為廣泛分布于各類水體的細(xì)菌門(mén)類，其豐度狀況與水體富營(yíng)養(yǎng)化程度密切相關(guān)。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)鹽和有機(jī)物的密集投入，水體長(zhǎng)期維持富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)，藍(lán)藻水華爆發(fā)已經(jīng)變得越來(lái)越頻繁[21]。斑點(diǎn)叉尾鮰池塘的藍(lán)藻含量雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的季節(jié)性差異，但是其相對(duì)豐度依然存在季節(jié)性的變化規(guī)律。春季3月和夏季7月斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘出現(xiàn)了兩次藍(lán)藻生物量的高峰，藍(lán)藻生物量占總細(xì)菌生物量的49.98%和56.77%，同時(shí)，3 月和7 月藍(lán)藻生物量的上升導(dǎo)致池塘水體細(xì)菌群落α 多樣性顯著降低。LefSe分析表明，春、夏和秋季藍(lán)藻門(mén)的顯著優(yōu)勢(shì)菌群各不相同。春季優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻主要是念珠藻目的g__norank_f__FamilyI_o__SubsectionIV屬，大 都 呈 絲狀，形成厚壁孢子，在長(zhǎng)換水周期、高pH、高溫和高光照強(qiáng)度等條件下，更具有優(yōu)勢(shì)[22]。斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體沒(méi)有劇烈波動(dòng)，冬春季pH 一直較高，3 月末溫度已經(jīng)接近15 ℃，營(yíng)養(yǎng)鹽也一直維持較高濃度，因此在3月末，藍(lán)藻迅速生長(zhǎng)，并導(dǎo)致了葉綠素a濃度的上升。之后4 月藍(lán)藻大量死亡并氧化分解，消耗水體溶氧并產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，導(dǎo)致4 月池塘溶氧含量降低，pH 也略有下降。夏季優(yōu)勢(shì)的顫藻屬Oscillatoria是常見(jiàn)的淡水藍(lán)藻群體，呈絲狀不分枝，會(huì)節(jié)律性顫動(dòng)。斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體夏季顫藻屬快速生長(zhǎng)，成為優(yōu)勢(shì)類群，并在7 月形成藍(lán)藻水華的最高峰，此時(shí)池塘水體葉綠素a 濃度也是全年最高，這個(gè)過(guò)程與開(kāi)放湖庫(kù)的夏季藍(lán)藻水華演替較為相似[23]。秋季g__norank_f__FamilyI_o__SubsectionI屬的藍(lán)藻替代顫藻屬成為優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻類群，該屬歸屬于藍(lán)藻綱Subsection I，皆為單細(xì)胞藍(lán)藻，有空泡，并合成藻膽蛋白，是湖泊、水庫(kù)等天然水體中秋季常見(jiàn)的水華藍(lán)藻種類[24]。

Monte Carlo 檢驗(yàn)和RDA 排序分析表明斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落與環(huán)境因子間具有顯著的相關(guān)性，主要的環(huán)境因子包括TDS、Temp、pH、NO-N和TOC。5 個(gè)環(huán)境因子都表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性差異，冬春季的TDS、pH 和TOC 顯著高于夏秋季，Temp 和NO-N 則是夏秋季顯著高于冬春季。其中，TDS 和Temp 對(duì)細(xì)菌群落的影響最大。TDS 能干擾水體的氧傳遞和降低細(xì)菌活性，從而影響硝酸鹽、有機(jī)物和COD 的去除[25]。大量的研究都表明溫度對(duì)細(xì)菌群落組成有重要影響。溫度會(huì)影響細(xì)菌降解有機(jī)物、再生營(yíng)養(yǎng)以及參與微食物鏈等方面的生物學(xué)功能[26-27]，同時(shí)還對(duì)水體浮游植物的演替產(chǎn)生影響，改變水體微生態(tài)系統(tǒng)[28]，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落組成的改變。水溫季節(jié)性的波動(dòng)造成棲息環(huán)境的季節(jié)性變化，進(jìn)一步推動(dòng)水體細(xì)菌群落組成呈現(xiàn)出季節(jié)性的響應(yīng)[29]。此外，不同菌群對(duì)溫度的敏感差異，也會(huì)導(dǎo)致不同溫度下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異[30]。斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘春季和夏季的水溫升高提高了藍(lán)藻門(mén)的生長(zhǎng)速率，并給藍(lán)藻門(mén)帶來(lái)了競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[31]，最終與其他因素共同導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘3月和7月的兩次藍(lán)藻爆發(fā)。

pH 被認(rèn)為是生物化學(xué)地球轉(zhuǎn)換過(guò)程中重要的調(diào)控因子，它能調(diào)節(jié)水體中離子和微量金屬的利用率，從而對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)起到抑制或者促進(jìn)的作用[32]。養(yǎng)殖水體光合作用的強(qiáng)弱對(duì)pH影響較大，因此pH會(huì)隨著光照強(qiáng)度和初級(jí)生產(chǎn)力的改變呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化。本研究中pH 冬春明顯高于夏秋，這可能與本試驗(yàn)池塘水體初級(jí)生產(chǎn)力相對(duì)較低有關(guān)，葉綠素a濃度明顯低于草魚(yú)、烏鱧和羅非魚(yú)等品種的養(yǎng)殖池塘[33-34]。同時(shí)，夏季池塘補(bǔ)水量大，可能也會(huì)引起pH的降低。N 和P 一直被認(rèn)為是細(xì)菌和浮游植物生長(zhǎng)的限制性因子[35]，TOC 也被認(rèn)為能夠直接影響細(xì)菌的生物量和組成，從而改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[36]。然而，斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖水體一直呈人為的富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)，大部分的營(yíng)養(yǎng)鹽（TN、NH-N、NO-N、TP 和PO-P）都沒(méi)有對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的塑造起到顯著性作用。而NO-N是水體中氮素存在的一個(gè)中間態(tài)，本研究池塘溶氧持續(xù)充足，整個(gè)養(yǎng)殖年度內(nèi)NO-N 濃度一直維持在較低的狀態(tài)。因此，NO-N的低濃度加上夏秋高冬春低的波動(dòng)，會(huì)對(duì)細(xì)菌群落如亞硝酸鹽硝化細(xì)菌等產(chǎn)生顯著的影響。斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體的C/N[可由TOC（/NH-N+NO-N+NO-N）粗略計(jì)算]只有7～14，遠(yuǎn)低于細(xì)菌生長(zhǎng)的最適范圍20～30[37]，因此C（主要是TOC）是斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘細(xì)菌生長(zhǎng)的限制因子。擬桿菌門(mén)的菌群能夠高效利用低碳物質(zhì)[38]，冬春季的TOC 濃度顯著高于夏秋季節(jié)（P＜0.05，表1），因此冬春季的擬桿菌門(mén)Bacteroidetes 豐度也顯著高于夏秋季。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用16S rDNA 擴(kuò)增技術(shù)研究斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘微生物群落，結(jié)果表明斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出季節(jié)性變化，優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)藻門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。環(huán)境因子中，總?cè)芙庑詰腋∥铩⑺疁?、酸堿度、亞硝酸鹽和總有機(jī)碳對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響。但是本研究局限于一個(gè)地方的斑點(diǎn)叉尾鮰池塘主養(yǎng)模式，而斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖已經(jīng)遍布全國(guó)，因此，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步針對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的不同養(yǎng)殖模式在不同地域開(kāi)展大尺度的養(yǎng)殖池塘微生物群落結(jié)構(gòu)比較，從而為不同地域不同模式的斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖管理提供精確理論指導(dǎo)。