董馨憶，柏春玲，鄧菊慶，李璠，吳怡

（昆明醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，云南 昆明 650000）

流式細(xì)胞儀是一種全自動(dòng)多色流式系統(tǒng)，兼具分析和分選雙相功能，并具有完整的多參數(shù)系統(tǒng)，能提供科研實(shí)驗(yàn)室和臨床所必需的客觀、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]。流式細(xì)胞技術(shù)作為一門生物檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)日臻完善，目前，該儀器已經(jīng)可以廣泛的應(yīng)用于植物倍性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中。

在植物倍性的檢測(cè)中，大量處理好的、處于分裂間期的植物細(xì)胞樣品經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)其中的DNA含量進(jìn)行檢測(cè)之后，經(jīng)儀器自帶的計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析后形成的非常直觀的DNA含量的分布曲線圖，我們就能看到該植物細(xì)胞樣品的峰值圖譜，再與已知的二倍體、四倍體的峰值圖譜比較之后，就能判斷出該樣品是屬于二倍體還是四倍體。

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)植物細(xì)胞DNA含量，用于判斷其倍性的方法雖然是簡(jiǎn)單有效，并且結(jié)果可靠，但是一定要特別注意檢測(cè)過(guò)程中，儀器參數(shù)的設(shè)置和調(diào)控。筆者長(zhǎng)期從事流式細(xì)胞儀的管理工作，通過(guò)長(zhǎng)期大量的實(shí)驗(yàn)后，總結(jié)出一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，謹(jǐn)以此文與大家分享交流。

1 儀器、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)使用的是德國(guó)生產(chǎn)的Partec品牌流式細(xì)胞儀，其型號(hào)為 CyFlow? Space。德國(guó)Partec是全球三大流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠家之一，其產(chǎn)品遍布全球180多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，該公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀具有卓越的性能和優(yōu)良的品質(zhì)。CyFlow? Space這個(gè)型號(hào)的流式細(xì)胞儀是該公司打造的新一代全能型流式細(xì)胞儀，有比較出眾的性能、也有靈活的配置空間以及方便快捷的操作。該儀器目前配備了3個(gè)激光光源，分別是488nm（激光器為Blue laser）、365nm（激光器為UV）、561nm（激光器為Yellow laser）、457nm（激光器為Dark Blue laser）、640nm（激光器為由軟件控制的Red laser），接收這些激光器的有FL-1至FL-13個(gè)光學(xué)通道，在具體的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者只需要根據(jù)樣品所使用的熒光染料，找到的合適的激光器來(lái)和對(duì)應(yīng)的接收通道，就可以實(shí)現(xiàn)大部分實(shí)驗(yàn)的需求。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們根據(jù)檢測(cè)植物倍性的染料，選用的激光器是365nm也稱為UV（紫外）激光器，選用的對(duì)應(yīng)接收通道為FL-9。

1.2 試劑

試驗(yàn)中使用的DAPI熒光染料也同樣購(gòu)自德國(guó)partec。DAPI熒光染料全稱為：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚。這是一種標(biāo)記可以用來(lái)做細(xì)胞DNA標(biāo)記的染料。該染料的標(biāo)記方式是以非嵌入方式與樣品DNA鏈上的A-T堿基對(duì)發(fā)生特異性的結(jié)合，當(dāng)DAPI染料與樣品的雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，DAPI的熒光強(qiáng)度可以增強(qiáng)，最大能夠增強(qiáng)200倍[2]。

1.3 樣品的制備

試驗(yàn)中所用的植物為經(jīng)過(guò)前期處理好的馬鈴薯嫩葉，切碎后加入DPAI熒光染料，用過(guò)濾網(wǎng)（至少300目）過(guò)濾3遍。取濾液離心后棄上清，加入1mL超純水混勻，離心后棄上清，準(zhǔn)備染色。在每管樣品中加入1mLDAPI，充分混勻。上樣前再次過(guò)濾，300目。將制備好的細(xì)胞懸液充分混勻，轉(zhuǎn)至3.5mL專用流式管中，備用。

2 流式檢測(cè)植物倍性的上機(jī)檢測(cè)

流式細(xì)胞儀打開UV激發(fā)光，調(diào)整好對(duì)應(yīng)的接收通道FL-9，進(jìn)樣速度調(diào)整至1，將染色好的樣品按照參照、樣品的順序逐一進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 坐標(biāo)圖的選擇

在流式細(xì)胞儀結(jié)果圖中，我們可以自由的選擇橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，但是一般情況下我們都要選擇的首先就是FSC與SSC的雙參數(shù)圖，該圖一般是用于目標(biāo)細(xì)胞群的選擇。FSC與SSC均為流式細(xì)胞儀的散射光信號(hào)，前者被稱為前向角散射，后者被稱為側(cè)向角散射，這兩種散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)（例如染色的處理等等），因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)[3]。前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)，側(cè)向角散射對(duì)細(xì)胞膜、質(zhì)膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。所以一般情況下，我們都會(huì)優(yōu)先選擇FSC/SSC雙參數(shù)的坐標(biāo)圖來(lái)首先選取目標(biāo)細(xì)胞[4][5]。

僅有一個(gè)FSC和SSC的坐標(biāo)圖是不夠的，我們還要根據(jù)實(shí)驗(yàn)所選用的染料來(lái)進(jìn)行選用其他坐標(biāo)圖。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中DAPI染料的接收通道，選用橫坐標(biāo)為FL-9的單參數(shù)直方圖。這是一個(gè)通過(guò)儀器的UV激光器激發(fā)了DAPI熒光染料，該染料發(fā)射出的光被儀器所接收到之后體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖，該直方圖就是為了看到我們所需要的DNA含量。

3.2 對(duì)照的重要性

為了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和精密性，一般情況下我們都需要在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照的目的是檢驗(yàn)對(duì)比試驗(yàn)的效果，沒(méi)有對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就將無(wú)法確定或者是無(wú)法判斷，所以在使用流式細(xì)胞儀對(duì)植物細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行檢測(cè)之前，首先要確定好每種樣品植物的已知二倍體作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。因?yàn)槲覀儗?duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)得到的結(jié)果只是一個(gè)峰型圖，我們必須以對(duì)照，也就是已知的二倍體為參照，給樣本DNA的含量提供一個(gè)位置的對(duì)比，才能判斷出該樣品的倍性。

如上圖（圖1）所示：這是一個(gè)流式典型的單參數(shù)直方圖，橫坐標(biāo)是植物細(xì)胞DNA含量，通道為FL-9，使用的是UV LED燈。這個(gè)圖為一個(gè)典型的二倍體圖，在圖中我們可以看到在橫坐標(biāo)的100和200的位置分別出現(xiàn)了兩個(gè)峰，其中橫坐標(biāo)100位置的這個(gè)峰高而且比較尖，其DNA含量我們?cè)O(shè)為N，而橫坐標(biāo)200位置的這個(gè)峰稍短，其DNA含量相對(duì)對(duì)100這個(gè)位置的來(lái)說(shuō)就應(yīng)該是2N，所以說(shuō)該樣品為二倍體。

3.3 參數(shù)調(diào)節(jié)的巧妙

在檢測(cè)過(guò)程中，值得注意的是要做好FL-9通道的電壓值的調(diào)節(jié)。在對(duì)照的檢查過(guò)程中，經(jīng)過(guò)幾次刷新后，結(jié)果的峰型圖已經(jīng)趨于穩(wěn)定，這個(gè)時(shí)候就要將已知二倍體的對(duì)照樣品的第一個(gè)高尖熒光峰調(diào)至橫坐標(biāo)的熒光道數(shù)為100處，調(diào)好之后不斷刷新、觀察，使100這個(gè)位置可以正好處于該峰型的中間，然后保持電壓不變，收集足夠多的信號(hào)。為什么一定要將第一個(gè)峰調(diào)至橫坐標(biāo)100的位置呢？這是為了更好地判斷其他峰的位置。只有第一個(gè)峰在橫坐標(biāo)100的位置，才能比較直觀的得知橫坐標(biāo)200位置的峰其DNA含量是其的2倍，也能比較直觀的得知橫坐標(biāo)400位置的峰其DNA含量是其的4倍。如果不將第一個(gè)峰調(diào)整至橫坐標(biāo)100的位置，那么我們?cè)谄渌宓呐袛嗌厦婢透鼮椴蝗菀?，可能需要仔?xì)的、費(fèi)時(shí)間的去數(shù)橫坐標(biāo)的刻度，這些都不太直觀，耗時(shí)且還會(huì)發(fā)生判斷錯(cuò)誤的情況。